Desenvolvimento de método para diagnóstico da paracoccidioidomicose humana utilizando antígeno recombinante de Paracoccidioides brasiliensis

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada por Paracoccidioides brasiliensis. É considerada a micose sistêmica de maior prevalência na América do Sul, principalmente no Brasil, o qual apresenta o maior número de casos. A glicoproteína de 43 kDa, gp43, é o principal antígeno utilizado...

Access Level:openAccess
Publication Date:2012
Main Author: Tatiana Reichert da Silva Assunção
Advisor: Mário Augusto Ono .
Referee: Eiko Nakagawa Itano, Elaine Cristina Teixeira Florian
Format: masterThesis
Language:por
Published: Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental.
Online Access:http://www.bibliotecadigital.uel.br/document/?code=vtls000172306
Portuguese Abstract:Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada por Paracoccidioides brasiliensis. É considerada a micose sistêmica de maior prevalência na América do Sul, principalmente no Brasil, o qual apresenta o maior número de casos. A glicoproteína de 43 kDa, gp43, é o principal antígeno utilizado no diagnóstico e epidemiologia da PCM. O objetivo deste trabalho foi produzir gp43 recombinante na forma solúvel para utilização no diagnóstico de PCM humana. Para a produção da proteína recombinante, primeiramente o gene gp43 foi clonado em vetor de expressão pETTEV. Algumas construções do gene neste vetor foram feitas com a finalidade de obter melhor expressão e solubilidade da proteína. Para isso, foram realizadas estratégias para deleção de 20 aminoácidos das regiões N-terminal e/ou C-terminal. A proteína, com deleção na região N-terminal (gp43ΔNt), foi produzida em E. coli BL21 e purificada por cromatografia de afinidade. Sua reatividade foi avaliada empregando-se soros de pacientes com PCM. A gp43ΔNt, apesar de ter sido obtida na forma insolúvel, apresentou semelhanças em relação à gp43 nativa e foi reconhecida por soros de pacientes com PCM nos testes de ELISA indireto, Western blot e dot blot. Os melhores resultados foram observados quando utilizada em dot blot, apresentando 100% de correlação com o teste de Imunodifusão Radial Dupla (IDRD) que é o método mais usado no diagnóstico da micose. Portanto, o teste de dot blot com gp43ΔNt pode ser útil no diagnóstico da PCM em humanos.
English Abstract:Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by Paracoccidioides brasiliensis. It is considered the most prevalent systemic mycosis in South America, mainly in Brazil, which presents the largest number of cases. The 43 kDa glycoprotein, gp43, is the main antigen used for diagnosis and epidemiology of PCM. The objective of this work was the production of the recombinant gp43 in soluble form for use in the diagnosis of human PCM. For the production of recombinant protein, first the gp43 gene was cloned in pETTEV expression vector. Some gene constructs in this vector were made in order to obtain better expression and solubility of protein. For this, were carried out strategies for deletion of 20 amino-acid in the N-terminal and/or C-terminal regions. The protein, with deletion in N-terminal (gp43ΔNt), was produced at E. coli BL21 and purified by affinity chromatography. Its reactivity was evaluated using sera from patients with PCM. The gp43ΔNt, despite having been obtained in insoluble form, showed similarities with native gp43 and was recognized by sera from patients with PCM in indirect ELISA test, Western blot and dot blot. The best results were observed when used in dot blot, presenting 100% of correlation with the double radial immunodiffusion test (IDRD), which is the widely used method in the diagnosis of this mycosis. Therefore, dot blot wiht gp43ΔNt may be useful for PCM diagnosis in humans.