Estudo comparativo da detecção de Doença Residual Mínima pelas técnicas de imunofenotipagem por citometria de fluxo e reação em cadeia da polimerase, em crianças e adolescentes com diagnóstico de Leucemia Linfoide Aguda

Introdução: As estratégias atuais de tratamento da leucemia linfoide aguda (LLA) da infância resultam em remissão de longo prazo em cerca de 90% das crianças acometidas, entretanto a probabilidade de evolução para a cura é menor dentre os pacientes que apresentam recidiva da doença. São propostos si...

Nível de Acesso:openAccess
Publication Date:2017
Main Author: Juliana Maria Camargos Rocha
Orientador/a: Benigna Maria de Oliveira
Co-orientador/a: Sandra Guerra Xavier
Banca: Marcos Borato Viana, Camila Silva Peres Cancela, Jose Andres Yunes, Juliana Godoy Assumpção
Format: Tese
Language:por
Published: Universidade Federal de Minas Gerais
Assuntos em Português:
TCR
Online Access:http://hdl.handle.net/1843/BUBD-AY4F7V
Resumo Português:Introdução: As estratégias atuais de tratamento da leucemia linfoide aguda (LLA) da infância resultam em remissão de longo prazo em cerca de 90% das crianças acometidas, entretanto a probabilidade de evolução para a cura é menor dentre os pacientes que apresentam recidiva da doença. São propostos sistemas de estratificação do risco de recidiva, através de fatores clínicos e biológicos, visando à oferta de tratamento eficaz aos pacientes classificados nos grupos de alto risco. A doença residual mínima (DRM) - persistência de células leucêmicas residuais em proporções submicroscópicas, verificada durante o tratamento - representa hoje o principal indicador prognóstico da LLA em crianças, podendo determinar a redefinição da quimioterapia iniciada. Os métodos laboratoriais atualmente recomendados para a detecção de DRM são a imunofenotipagem por citometria de fluxo (CF) e a análise de rearranjos clonais dos genes de Ig e TCR por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RQ-PCR). Ambos apresentam bom desempenho na detecção de células leucêmicas residuais, entretanto são onerosos, demandam pessoal qualificado para a sua realização e são restritos a centros especializados, especialmente a RQ-PCR. Objetivos: Comparar as análises de DRM por CF e PCR convencional, em amostras colhidas ao final das fases de indução da remissão (D35) e consolidação da remissão (D78), e correlacionar os dados obtidos com as principais características clínicas dos pacientes com LLA. Metodologia: A população de estudo foi constituída por 42 pacientes com diagnóstico recente de LLA (35 LLA B e 7 LLA T), admitidos no Hospital das Clínicas da UFMG (HC/UFMG) no período entre setembro de 2013 e dezembro de 2016, e tratados de acordo com o protocolo do Grupo Brasileiro de Tratamento das Leucemias Agudas da Infância (GBTLI LLA-2009). As amostras de medula óssea (MO) dos pacientes incluídos no estudo foram avaliadas ao diagnóstico por CF, para caracterização imunofenotípica dos blastos e, por PCR convencional, para detecção de rearranjos clonais dos genes de Ig e TCR. A DRM foi avaliada por CF nas amostras de MO colhidas nos dias 15, 35 e 78 do tratamento e, por PCR convencional, nas amostras dos pontos D35 e D78. Resultados: Foram realizadas 107 análises de DRM por CF e 63 por PCR convencional. Considerando o ponto de corte de 0,01% para definição de positividade, a DRM foi detectada por CF em 87,8%, 17,1% e 28% das amostras analisadas nos tempos D15, D35 e D78, respectivamente. Por PCR convencional, a DRM foi detectada em 13,2% e 12% das amostras analisadas nos tempos D35 e D78, respectivamente. Avaliações pareadas de DRM por CF e PCR convencional foram realizadas em 61/68 (89,7%) amostras de MO colhidas nos pontos D35 e D78. A taxa de concordância geral entre as duas metodologias foi de 88,5%, sendo maior nas análises do D35 (91,9%; Kappa: 0,62), em comparação com as análises do D78 (83,3%; Kappa: 0,52). Os resultados discordantes foram esclarecidos pela metodologia de RQ-PCR, que evidenciou quatro resultados falso-positivos da CF, um falso-negativo da CF e dois falso-negativos da PCR convencional. Em análise de associação envolvendo os fatores prognósticos, foi verificada associação significativa entre linhagem celular acometida e DRM por PCR convencional, nos dois pontos de avaliação (D35: p = 0,037; D78: p = 0,032), sendo maior a frequência de detecção de DRM na LLA-T. O tempo de seguimento clínico dos pacientes variou de 6 a 46 meses (mediana: 27 meses). A probabilidade estimada de sobrevida global (SGLO) aos 3,8 anos foi de 75,1% (± 9,9%) e a probabilidade estimada de sobrevida livre de eventos (SLE) foi de 50,5% (± 21,4%). Foram observadas maiores SGLO e SLE no grupo de pacientes com LLA-B, em comparação ao grupo de pacientes com LLA-T (p = 0,001 e p = 0,001, respectivamente), assim como no grupo de pacientes com contagem de leucócitos ao diagnóstico inferior a 50.000 cel/µL, se comparado ao grupo com leucometria igual ou superior a 50.000 cel/µL (p = 0,0001 e p = 0,00009, respectivamente). Conclusão: As metodologias de CF e PCR convencional apresentam resultados comparáveis na detecção de DRM na LLA infantil, em amostras colhidas em fases de regeneração medular. Constituem métodos acessíveis a regiões com recursos financeiros e tecnológicos restritos, podendo ser utilizadas de forma complementar, com o intuito de propiciar a monitorização do tratamento quimioterápico a um maior número de crianças com LLA. Maior tempo de seguimento e maior número de casos são necessários para que sejam obtidos resultados consistentes nas análises de sobrevida.
Introduction: Current treatment strategies of childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL) result in a long-term remission rate of about 90%, however the chance of cure is less among patients who relapse. Stratification schemes using clinical and biological factors have been proposed to classify patients for the relapse risk, with the ultimate goal of offering high-risk patients an effective treatment. The detection of minimal residual disease (MRD) leukemic residual cells in small proportions, verified during the treatment currently represents the main prognostic factor of ALL in children and can suggest a change in the previously started chemotherapeutic treatment. The methods currently recommended to detect MRD are multiparameter flow cytometry (FC) and quantitative real time polymerase chain reaction (RQPCR) of the clonal rearrangements regions of T-cell receptor (TCR) and/or immunoglobulin (Ig) genes. Both methods show good performance in detecting leukemic residual cells, but they are expensive, require qualified staff and are frequently restricted to reference centers, especially the RQ-PCR. Thus, the aim of this study was to investigate whether FC and conventional PCR have good concordance in the detection of MRD at the end of the remission induction phase (D35) and at the end of the remission consolidation phase (D78) of childhood ALL treatment. We also evaluated associations between the DRM results and clinical data of ALL patients. Methods: Between September 2013 and December 2016, 42 children admitted to the Hospital das Clínicas/UFMG with recent ALL diagnosis (35 with B-ALL and 7 with T-ALL) were prospectively studied. The patients were treated according to the protocol of the Brazilian Group for the Treatment of Childhood Acute Leukemia (GBTLI LLA-2009). The bone marrow (BM) samples collected at diagnosis were evaluated by FC, for the immunophenotypic characterization of leukemic cells, and by PCR, for the detection of clonal rearrangements of Ig and TCR genes. The MRD was monitored by FC in the BM samples collected on days 15, 35 and 78 of the treatment and, by PCR, on days 35 and 78. Results: MRD measurements were performed in 107 samples by FC and in 63 samples by conventional PCR. Using 0.01% as a cutoff point, MRD was detected by FC in 87.8%, 17.1% and 28% of the samples taken at D15, D35 and D78, respectively. Otherwise, by PCR, MRD was detected in 13.2% and 12% of the samples analyzed at D35 and D78, respectively. MRD was evaluated by both assays in 61/68 (89.7%) samples collected at D35 and D78. The overall concordance between the two methods was 88.5%, being greater at D35 (91.9%; Kappa: 0.62) in comparison with the D78 analysis (83.3%; Kappa: 0.52). The discordant results were elucidated by the RQ-PCR. When prognostic factors were analyzed, the affected cellular lineage was significantly associated with PCR in both time points (D35: p = 0.037; D78: p = 0.032), being greater the MRD detection frequency in T-ALL subjects. The clinical follow-up period varied from 6 to 46 months (median: 27 months). The overall survival rate (OS) at 3.8 years was 75.1% (± 9.9%) and the event-free survival rate (EFS) was 50.5% (± 21.4%). Higher OS and EFS were observed in B-ALL patients than in T-ALL patients (p = 0,001 and p = 0,001, respectively) and also in patients with white blood cell (WBC) less than 50.000 cells/µL when compared to those with WBC greater than or equal to 50.000 cells/µL (p = 0.0001 and p = 0,00009, respectively). Conclusion: MRD detection by FC and conventional PCR showed comparable results in childhood ALL, when samples were collected at medullar regeneration phases. Both methods are accessible to regions with restricted financial and technological resources and, when concurrently used, may be an effective tool to monitor the chemotherapeutic treatment of children with ALL. Further studies including additional time and a larger number of cases are needed to obtain a more consistent survival analysis.