Caracterização molecular e bioquímica de cepas de Saccharomyces cerevisiae utilizadas na caracterização molecular e bioquímica

Com o objetivo de caracterizar molecularmente a cepa Saccharomyces cerevisiae LBCM 427, selecionada a partir de dornas de fermentação de cachaça, utilizaram-se várias metodologias de análise de polimorfismo de DNA para permitir a discriminação entre esta e as cepas presentes no local de origem. Os r...

Nível de Acesso:openAccess
Publication Date:2007
Main Author: Vicente, Maristela de Araújo
Orientador/a: Brandão, Rogélio Lopes
Format: Tese
Language:por
Published: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
Assuntos em Português:
Online Access:http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/2713
Citação:VICENTE, M. de A. Caracterização molecular e bioquímica de cepas de Saccharomyces cerevisiae utilizadas na caracterização molecular e bioquímica. 2007. 124p. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2007.
Resumo Português:Com o objetivo de caracterizar molecularmente a cepa Saccharomyces cerevisiae LBCM 427, selecionada a partir de dornas de fermentação de cachaça, utilizaram-se várias metodologias de análise de polimorfismo de DNA para permitir a discriminação entre esta e as cepas presentes no local de origem. Os resultados demonstraram que RAPD-PCR, mtDNA, e PCR utilizando primers complementares a região do gene COXI não foram suficientes para uma boa diferenciação entre a cepa LBCM 427 e cepas isoladas na mesma dorna de fermentação. Por outro lado, o uso da cariotipagem para diferenciação com base no perfil cromossomal permitiu uma nítida distinção entre o grupo de cepas analisadas. Estes resultados demonstram que o uso de cepas iniciadoras requer um acompanhamento com o uso combinado de métodos bioquímicos e moleculares. A cepa parenteral LBCM 427, foi segregada e as tétrades analisadas quanto a estabilidade fisiológica e bioquímica em passagens sucessivas. Avaliaram-se os seguintes parâmetros floculação, não produção de H2S, resistência a 5,5´,5´´-trifluoro-DLleucina (TFL) e cerulenina, crescimento em diferentes condições de pressão osmótica e de temperatura. Os resultados demonstraram que nenhuma cepa segregante reuniu todas as características da cepa parental. Diante disto, foi selecionada uma cepa segregante que atendia ao critério de resistência a TFL e cerulenina para analisar o comportamento em uma fermentação em caldo de cana e possíveis mutações no gene LEU4 que transcreve para a - isopropilmalato sintase. Esta segregante não foi afetada na presença de altas concentrações de L-leucina (20 mM) e, apresentou mutações no gene LEU4 ainda não descritas pela literatura. A cepa LBCM 427 e segregante foram avaliadas quanto à produção de cachaça em escala piloto. Os parâmetros analisados foram: o perfil químico da bebida produzida e a adaptação das cepas em condições similares às encontradas na fabricação artesanal da cachaça. Por cromatografia gasosa, quantificaram-se os compostos voláteis sendo estes o acetaldeído, acetato de etila, metanol, n-propanol, isobutanol, álcool isoamílico, e furfural. Verificou-se que as cepas LBCM 427 e segregante produzem elevados teores de álcool isoamílico e álcool isobutílico quando comparadas a uma cepa Saccharomyces cerevisiae comercial utilizada como controle. Outra cepa utilizada como controle do processo, a cepa nativa LBCM 422, sensível a ambos compostos, produziu quantidades semelhantes de álcool isoamílico quando comparada às cepas LBCM 427 e segregante, resistentes a TFL e cerulenina. Os resultados apresentados oferecem uma importante contribuição para o desenvolvimento de novas estratégias de seleção de cepas selvagem com características específicas, levando a produção da cachaça com maior produção de compostos flavorizantes. _________________________________________________________________________________________
ABSTRACT: Aiming the molecular characterization of Saccharomyces cerevisiae LBCM 427 strain, selected from fermentations vats of a cachaça distillery, several analysis using polymorphism analysis of DNA for the characterization/discrimination of this and the selvagem strains present in the origin place was used. Results showed that RAPD-PCR, mtDNA, and PCR using complementary primers COXI gene region were not sufficient for distinguishing among them. On the other hand, the chromosomal pattern profile of kariotyping showed to be useful to discriminate the strains studied. These results showed that use of starting strains requires the combined use of biochemical and molecular methods for monitoring start strains. The parental strain LBCM 427, was sporulated and its tetrads were analyzed for physiologic and biochemical stability through successive generations. We selected the strains for: capacity flocculation, no H2S production, 5, 5´,5´´-trifluoro-DL-leucine (TFL) and cerulenin resistance and ability to adapt to stress conditions during fermentation of the sugarcane juice such as high osmotic concentration and temperature. No single segregant was found that kept entirely all the characteristics of the parental strain. In view of this result, a segregant keeping the characteristic of resistance to TFL and cerulenin compounds was selected for analysis of fermentation of sugar cane juice and probable mutation in the LEU4 gene that encodes for alpha isopropylmalate synthase (alpha-IPM). This segregant showed that alpha-IPM activity was not affected by the presence of increasing leucine concentrations (20 mM), and showed a new mutation in the LEU4 gene which has not been previously described in the literature. LBCM 427 and segregant strains were submitted to a small-scale distillation for cachaça production. The parameters analysed were the chemical profile of the product as well as strain ability to adapt to stress conditions during fermentation of the sugarcane juice in artisanal cachaça`s factory. Volatile compounds such as acetaldehyde, ethyl acetate, methanol, n-propanol, isobutyl alcohol, isoamyl alcohol and furfural were quantified by gas chromatography assays. It was found that LBCM 427 and segregant strains produced higher level of isoamyl alcohol and isobutyl alcohol compared with control S. cerevisie strains of the process. Another strain, LBCM 422 native S. cerevisiae strain, sensitive to both TFL and cerulenin, a control strain for the fermentation process, produced similar levels of isoamyl alcohol in relation to both LBCM 427 and TFL and cerulenin resistant segregant strain. The results offer an important contribution for the development of a strategy for strains selection from fermentation vats of cachaça distillery, showing higher production capacity of flavouring substances.