Determinação de compostos fenólicos como marcadores analíticos em extratos de plantas medicinais da Amazônia por UHPLC-ESI-MS/MS

A method for separation, identification and quantification of 24 phenolic compounds using ultra-high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (UHPLCMS/ MS) was developed and validated. Six plant species originating from the Brazilian Amazon region and traditionally used...

Nível de Acesso:openAccess
Publication Date:2016
Main Author: Faccin, Henrique lattes
Orientador/a: Carvalho, Leandro Machado de lattes
Banca: Pizzutti, Ionara Regina lattes, Silva, Diogo de Oliveira lattes
Format: Dissertação
Language:por
Published: Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências Naturais e Exatas
Programa: Programa de Pós-Graduação em Química
Department: Química
Assuntos em Português:
Assuntos em Inglês:
Áreas de Conhecimento:
Online Access:http://repositorio.ufsm.br/handle/1/17701
Resumo Português:Um método para separação, identificação e quantificação de 24 compostos fenólicos utilizando cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massas sequencial (UHPLC-MS/MS) foi desenvolvido e validado. Seis espécies vegetais originárias da região amazônica brasileira e tradicionalmente utilizadas como plantas medicinais pela população local foram estudadas (Mansoa alliacea, Bauhinia variegata var. variegata, Bauhinia variegata var. alboflava, Connarus perrottetii var. angustifolius, Cecropia obtusa e Cecropia palmata). Os analitos foram separados por uma coluna de fase reversa SB-C18 (2,1 × 50 mm, 1,8 μm) utilizando um gradiente de eluição composto por ácido acético 0,1% em água (v/v) e acetonitrila, a uma vazão constante de 0,8 mL min-1. O limite de detecção variou entre 0,5 e 130,3 μg kg-1. A repetibilidade e a precisão intermediária apresentaram resultados satisfatórios e as recuperações obtidas para os 24 analitos variaram entre 91,7 e 123,8% para as matrizes avaliadas. Ademais, um estudo sistemático das várias fontes de supressão iônica em análises por UHPLC-MS/MS foi realizado para os 24 compostos fenólicos em extratos das seis plantas medicinais. As contribuições para a supressão iônica global do método foram avaliadas pela ótica dos efeitos de matriz, dos aditivos de fase móvel, da coeluição de analitos e da competição por cargas elétricas durante a ionização. Neste âmbito, a influência dos aditivos de fase móvel sobre a eficiência de ionização mostrou-se muito pronunciada, onde efeitos de supressão iônica de aproximadamente 90% e efeitos de enriquecimento iônicos maiores que 400% puderam ser observados. Os efeitos negativos causados pela escolha errônea de padrões internos em estudos de quantificação foram também avaliados e discutidos a partir da perspectiva da supressão iônica. Este trabalho também mostrou a importância de se realizar estudos com tal abordagem mesmo para matrizes muito semelhantes, como variedades de uma mesma espécie vegetal, tendo em vista os diferentes efeitos de supressão iônica observados entre matrizes, para um mesmo analito. Além disso, ensaios de quantificação dos 24 analitos foram realizados pelo método de adição do padrão (r > 0,99) utilizando dados adquiridos pelo modo de monitoramento de reações selecionadas (SRM). Rutina, apigenina e os ácidos vanílico, cafeico, p-cumárico, ferúlico e trans-cinâmico foram determinados em todas as plantas estudadas em pelo menos um dos extratos analisados. Deve ser destacado o alto conteúdo de rutina nas variedades de Bauhinia variegata (até 2,52 mg g-1 de planta), ácido clorogênico em espécies do gênero Cecropia (até 0,57 mg g-1 de planta) e catequina em Connarus perrottetii var. angustifolius (1,77 mg g-1 de planta). Possíveis marcadores analíticos e potenciais marcadores ativos para controle de qualidade de medicamentos fitoterápicos foram designados para cada espécie vegetal estudada.
Resumo inglês:A method for separation, identification and quantification of 24 phenolic compounds using ultra-high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (UHPLCMS/ MS) was developed and validated. Six plant species originating from the Brazilian Amazon region and traditionally used as medicinal plants by local people were studied (Mansoa alliacea, Bauhinia variegata var. variegata, Bauhinia variegata var. alboflava, Connarus perrottetii var. angustifolius, Cecropia obtusa and Cecropia palmata). The analytes were separated by a reversed phase SB-C18 column (2.1 × 50 mm, 1.8 μm) using a gradient elution composed of 0.1% acetic acid in water (v/v) and acetonitrile, at a constant flow rate of 0.8 mL min-1. The limit of detection ranged between 0.5 and 130.3 μg kg-1. Intra- and inter-day precision showed satisfactory results and the recoveries obtained for the 24 analytes varied between 91.7 and 123.8% for the evaluated matrices. Moreover, a systematic study on the various sources of ion suppression in UHPLC-MS/MS analysis was carried out for the 24 phenolic compounds in extracts of all the six medicinal plants. The contributions of matrix effects, mobile-phase additives, analyte co-elution and electric charge competition during ionization to the global ion suppression were evaluated. Herein, the influence of mobile-phase additives on the ionization efficiency was found to be very pronounced, where ion suppression of approximately 90% and ion enhancement effects greater than 400% could be observed. The negative effect caused by the wrong choice of internal standard (IS) on quantitative studies was also evaluated and discussed from the perspective of ion suppression. This work also shows the importance of performing studies with this approach even for very similar matrices, such as varieties of medicinal plants from the same species, because different effects were observed for the same analyte. Furthermore, quantification determinations of the 24 analytes were performed with the standard addition method (r > 0.99) using data acquired in selected reaction monitoring (SRM) mode. Rutin, apigenin, vanillic acid, caffeic acid, p-coumaric acid, ferulic acid and trans-- cinnamic acid were found in all the studied plants in at least one of the analysed extracts. It should be emphasized the high content of rutin in varieties of Bauhinia variegata (up to 2.52 mg g-1 of plant), chlorogenic acid in species of genus Cecropia (up to 0.57 mg g-1 of plant) and catechin in Connarus perrottetii var. angustifolius (1.77 mg g-1 of plant). Possible analytical markers and potential active markers for quality control of herbal drugs were assigned to each plant species.