Correlação entre a expressão dos genes da subunidade α da β-conglicinina e GmFAD2-1A durante o desenvolvimento da semente de soja

The increase of the oleic acid content and decrease of the polyunsaturated fatty acids levels (linolenic and linoleic) in the soybean seed may be achieved by reducing of the microsomal ω-6 desaturase enzyme activity through GmFAD2-1A gene silencing which codify this enzyme, resulting in the...

Nível de Acesso:openAccess
Publication Date:2010
Main Author: Cunha, Pricila da Silva lattes
Orientador/a: Moreira, Maurílio Alves lattes
Co-advisor: Fietto, Luciano Gomes lattes, Barros, Everaldo Gonçalves de lattes
Banca: Fietto, Juliana Lopes Rangel lattes, Oliveira, Márcia Rodrigues Carvalho lattes
Format: Dissertação
Language:por
Published: Universidade Federal de Viçosa
Programa: Mestrado em Bioquímica Agrícola
Department: Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal
Assuntos em Português:
Assuntos em Inglês:
Áreas de Conhecimento:
Online Access:http://locus.ufv.br/handle/123456789/2418
Citação:CUNHA, Pricila da Silva. Correlation between the genes expression of the β-conglycinin α subunit and GmFAD2-1A during soybean seed development. 2010. 125 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2010.
Resumo Português:O aumento no conteúdo de ácido oléico e diminuição nos níveis dos ácidos graxos polinsaturados (linolênico e linoléico) na semente de soja pode ser alcançado pela redução da atividade da enzima ω-6 dessaturase microssomal através do silenciamento do gene GmFAD2-1A que codifica para essa enzima, resultando na produção de óleos com elevada estabilidade oxidativa. O silenciamento deve ocorrer especificamente na semente de forma a não alterar as características agronômicas da planta e não interferir negativamente no seu crescimento e desenvolvimento. Para isso, o transgene deve estar sob controle de um promotor semente-específico como o promotor do gene da subunidade α da β-conglicinina (promotor pBC). O principal objetivo desse trabalho foi correlacionar o padrão de expressão do gene que codifica a subunidade α da β-conglicinina (gene BC) com o padrão de expressão do gene GmFAD2-1A ao longo do desenvolvimento da semente de soja em cinco variedades que diferem quanto ao teor protéico ("normal" e "alto") e ao ciclo de vida (precoce e tardio). E, através dessa correlação, analisar se opromotor pBC apresenta potencial para ser usado em futuros experimentos de transformação genética de soja que tenha como objetivo silenciar o gene GmFAD2-1A. A análise do padrão de expressão dos genes BC e GmFAD2-1A foi feita por PCR em Tempo Real (qRT-PCR) utilizando dois controles endógenos (GAPDH e EF1b). A subunidade α da β-conglicinina foi quantificada por SDSPAGE/ densitometria durante o desenvolvimento da semente em todos os cinco cultivares. De modo geral, a concentração da subunidade α daβ-conglicinina foi inferior em estádios iniciais de desenvolvimento da semente, aumentando em estádios do meio para o final da maturação, indicando que ocorreu um acúmulo desse polipeptídeo ao longo do enchimento do grão, e apresentando uma concentração alta e significativa na semente madura. As variedades de teor protéico "normal" apresentaram concentrações superiores da subunidade α quando comparadas com suas respectivas isolinhas de maiores teores protéicos, o que ocorreu em estádios do meio para o final da maturação. Os dois genes endógenos (GAPDH e EF1b) normalizaram os dados de expressão dos genes BC e GmFAD2-1A de modo muito similar, com as principais diferenças ocorrendo nos perfis de expressão dos dois genes alvos em estádios do meio e final da maturação nas variedades de ciclo precoce. Entretanto, GAPDH foi melhor normalizador do que EF1b, mostrando expressão mais estável entre todos os tratamentos. De modo geral, o gene BC apresentou maior padrão de expressão em estádios do início e meio da maturação da semente, sendo que nesses estádios pode-se sugerir que o promotor pBC atingiu sua capacidade máxima para ativar a transcrição do gene alvo, com a expressão do gene BC diminuindo em direção aos estádios finais de desenvolvimento da semente. Pode-se sugerir que essa diminuição na expressão do gene BC esteja associada à uma diminuição na atividade do promotor pBC, embora ele ainda permanecesse suficientemente ativo para garantir um nível alto de expressão do transgene em futuros experimentos transformação genética de soja. Nenhuma diferença significativa foi encontrada no padrão de expressão do gene BC quando se comparou uma variedade de soja e sua respectiva isolinha de maior teor protéico ao longo do desenvolvimento da semente. De modo geral, enquanto a concentração da subunidade α foi inferior em estádios iniciais da maturação (1° e 2°), o gene BC apresentou maior padrão de expressão em estádios do início e meio do desenvolvimento da semente (2° e 3°). A partir do 3° estádio em direção ao final da maturação, houve um aumento na concentração da subunidade α enquanto verificou-se uma diminuição na expressão do gene BC em vários desses estádios. A principal diferença foi encontrada na semente madura de todas as variedades que apresentou uma alta concentração do polipeptídeo, apesar de uma expressão quase nula do gene BC. De forma geral, não foi encontrado um padrão de expressão do gene BC e de concentração da subunidade α que permitisse diferenciar o grupo de variedades de ciclo tardio do grupo de ciclo precoce. Em relação ao gene GmFAD2-1A, de modo geral, as variedades de ciclo tardio apresentaram maior padrão de expressão gênica em estádios do meio para o final do desenvolvimento da semente, enquanto nos cultivares de ciclo precoce o gene GmFAD2-1A mostrou maior padrão de expressão em estádios do início e meio da maturação. Assim como para o gene BC a expressão de GmFAD2-1A foi quase nula na semente madura para todas as variedades. De modo geral, a correlação entre o padrão de expressão dos genes BC e GmFAD2-1A nas variedades de ciclo tardio mostrou que nos estádios em que houve maior taxa de transcrição do gene GmFAD2-1A a expressão do gene BC diminuiu após atingir um pico de expressão no 3° estádio. Entretanto, a expressão do gene BC foi ainda superior à do gene GmFAD2-1A nesses estádios. Dessa forma, para os cultivares de ciclo tardio, nos estádios em que o gene GmFAD2-1A apresentou os maiores valores de expressão pode-se sugerir que o promotor pBC está ativo ou com uma capacidade máxima para ativar a transcrição do gene alvo. Nos cultivares de ciclo precoce essa correlação mostrou que os genes BC e GmFAD2-1A apresentaram um padrão de expressão semelhante, com valores elevados de expressão gênica em estádios do início e meio da maturação (2° e 3°), diminuindo em estádios posteriores de desenvolvimento da semente. Portanto, pode-se sugerir que a maior atividade do promotor pBC ocorreu nos mesmos estádios em que foram encontrados os maiores valores de expressão do gene GmFAD2-1A. Dessa forma, pode-se sugerir que o promotor do gene da subunidade α daβ-conglicinina apresenta elevado potencial para ser usado em futuros experimentos de transformação genética que tenha como objetivo silenciar o gene GmFAD2-1A ao longo do desenvolvimento da semente de soja em todos os cultivares analisados.
Resumo inglês:The increase of the oleic acid content and decrease of the polyunsaturated fatty acids levels (linolenic and linoleic) in the soybean seed may be achieved by reducing of the microsomal ω-6 desaturase enzyme activity through GmFAD2-1A gene silencing which codify this enzyme, resulting in the production of oils with high oxidative stability. The gene silencing must occur specifically in the seed, as it must not alter plant agronomics characteristics and not to interfere negativelly with plant growth and development. For that, the transgene must be under the control of a seed-specific promoter such as the promoter of the β-conglycinin α subunit gene (pBC promoter). The main objective of this work was to correlate the gene expression pattern that codify the β-conglycinin α subunit (BC gene) with the GmFAD2-1A gene expression pattern during the soybean seed development in five soybean cultivars that differ in the protein content ("normal" and "high") and life cycle (early and late maturity). And, through this correlation, to analyse if the pBC promoter presents potential to be used in future experiments of soybean genetic transformation which has as goal to silence the GmFAD2-1A gene. The analysis of the BC and GmFAD2-1A genes expression pattern was done by Real Time PCR (qRT-PCR) using two endogenous controls (GAPDH and EF1b). The β-conglycinin α subunit was quantified bySDS-PAGE/densitometry during seed development in all five cultivars. In general, the β-conglycinin α subunit concentration was lower in initial stages of seed development, increasing in middle stages towards the final of maturation, indicating that there was an accumulation of this polypeptide during the seed filling, and presenting a high and significative concentration in the mature seed. The cultivars of "normal" protein content showed higher α subunit concentrations when compared with their respective isolines of higher protein content, which occurred in middle stages towards the final maturation. The two endogenous genes (GAPDH and EF1b) normalized the BC and GmFAD2-1A genes expression data in a very similar way, with the main differences occurring in the expression patterns of the two targets genes in the middle and final stages of maturation in the early maturity cultivars. However, GAPDH was a better normalizer gene than EF1b, showing a more stable expression among all treatments. In general, the BC gene showed higher expression pattern in initial and middle stages of the seed maturation, and in these stages can be suggested that the pBC promoter reached its maximum capacity to activate transcription of the target gene, with the BC gene expression decreasing towards final stages of the seed development. It can be suggested that this decreasing in BC gene expression is associated with a decreasing in pBC promoter activity, although the pBC promoter still remains sufficiently active to ensure a high level of transgene expression in future experiments of soybean genetic transformation. None significative difference was found in BC gene expression pattern when was compared a soybean cultivar and its respective isoline of higher protein content during seed development. In general, while the α subunit concentration was lower in initial stages of maturation (1st and 2nd), the BC gene showed a higher expression pattern in initial and middle stages of seed development (2nd and 3rd). From the third stage towards the final of maturation, there was an increase in the α subunit concentration while there was a decreasing in BC gene expression in several of these stages. The main difference was found in mature seed of all cultivars, which showed a high polypeptide concentration despite of an almost null expression of the BC gene. In general, it was not found a BC gene expression pattern and of α subunit concentration that allowed to differentiate the group of late maturity cultivars of the group of early maturity cultivars. For the GmFAD2-1A gene, in general, the late maturity cultivars showed highergene expression pattern in middle stages towards the final of seed development, while in early maturity cultivars the GmFAD2-1A gene showed higher expression pattern in initial and middle stages of maturation. In the same manner as for the BC gene, the GmFAD2-1A gene expression was almost null in the mature seed for all cultivars. In general, the correlation between the pattern of BC and GmFAD2-1A genes expression in the late maturity cultivars showed that at stages where there were a higher rate of GmFAD2-1A gene transcription the expression of BC gene decreased after to reach a peak of expression in third stage. However, the BC gene expression was still higher than the GmFAD2-1A gene at these stages. Thus, for the late maturity cultivars, at stages where the GmFAD2-1A gene showed the highest expression values can be suggested that the pBC promoter is active or it is with a maximum capacity to activate the target gene transcription. In early maturity cultivars this correlation showed that the BC and GmFAD2-1A genes presented a similar expression pattern, with high levels of genes expression in initial and middle stages of maturation (2nd and 3rd), decreasing in later stages of seed development. Therefore, it can be suggested that the highest pBC promoter activity occurred in the same stages where the highest values of GmFAD2-1A gene expression were found. Thus, it can be suggested that the promoter of the β-conglycinin α subunit gene presents a high potential to be used in future experiments of genetic transformation which has as goal to silence the GmFAD2-1A gene during the soybean seed development in all cultivars analysed.