Influência das fontes de carbono na indução de celulases e hemicelulases em Chrysoporthe cubensis cultivado em meio líquido

Results obtained recently in our research group (Production and Characterization of biotechnological interest Enzyme) have demonstrated that Chrysoporthe cubensis, fungal pathogen of eucalyptus, has showed potential for producing enzymes involved in saccharification of lignocellulosic biomass. In th...

Nível de Acesso:openAccess
Publication Date:2013
Main Author: Dutra, Thiago Rodrigues lattes
Orientador/a: Rezende, Sebastião Tavares de lattes
Co-advisor: Falkoski, Daniel Luciano lattes
Banca: Guimarães, Valéria Monteze lattes, Fietto, Luciano Gomes lattes, Fialho, Lílian da Silva lattes
Format: Dissertação
Language:por
Published: Universidade Federal de Viçosa
Programa: Mestrado em Bioquímica Agrícola
Department: Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal
Assuntos em Português:
Assuntos em Inglês:
Áreas de Conhecimento:
Online Access:http://locus.ufv.br/handle/123456789/2463
Citação:DUTRA, Thiago Rodrigues. Influence of carbono sources on induction of celullase and hemicellulase in Chrysoporthe cubensis grown in submerged culture. 2013. 56 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2013.
Resumo Português:Resultados recentes obtidos em nosso grupo de pesquisa (Produção e Caracterização de Enzimas de Interesse Biotecnológico) têm demonstrado que Chrysoporthe cubensis, fungo patógeno de eucalipto, possui potencial para produção de enzimas para a sacarificação da biomassa lignocelulósica. Neste estudo o fungo foi cultivado em diversas fontes de carbono sob condições submersas, a fim de observar a produção de celulases e hemicelulases extracelulares. Foram testados como indutores de atividade enzimática fontes de carbono complexas como farelo de trigo, carboximetilcelulose CMC, xilana Birchwood XB, Locust bean gum LBG, pectina de citrus peel CP e também fontes de carbono mais simples como glicose, celobiose, lactose, galactose, manose, xilose e arabinose. C. cubensis produziu os maiores níveis de atividades celulolíticas e hemicelulolíticas quando crescido em farelo de trigo e CMC. Quando cultivado em farelo de trigo C. cubensis produziu as atividades β-glicosidase, endoglicanase e xilanase de 0,36 U/mL, 3,6 U/mL, 14,2 U/mL, respectivamente. Quando cultivado em CMC, C. cubensis produziu atividades de β-glicosidase, endoglicanase e xilanase de 0,48 U/mL, 2,8 U/mL, 10,7 U/mL, respectivamente. Quando C. cubensis cresceu em xilana birchwood apresentou atividade de xilanase de 9,9 U/mL, porém não foi eficaz na produção de celulases. Fontes de carbono simples apresentaram, de maneira geral, baixa capacidade de indução de celulases e hemicelulases em C. cubensis. Zimograma contendo substrato fluorescente metillumbelliferil β-D-glicopiranosideo, demonstrou que C. cubensis foi capaz de produzir atividade de β-glicosidase quando cultivado em todas as fontes de carbono, exceto em manose e galactose. Extratos produzidos por C. cubensis cultivado em fontes complexas, apresentaram uma β-glicosidase de 55,6 kDa. A presença de possíveis complexos de altos pesos moleculares, contendo atividade de β-glicosidase, também foi detectada. Dentre os extratos produzidos por C. cubensis em presença de fontes simples, o substrato lactose induziu a produção do mesmo grupo de β-glicosidases que as fontes de carbono complexas no fungo. Extratos produzidos pelo fungo cultivado tanto em xilose quanto em arabinose também apresentaram bandas de atividades com elevados pesos moleculares. Extratos produzidos por C. cubensis cultivado em xilose apresentaram ainda uma β-glicosidase de 74 kDa. Já os extratos produzidos por cultivos em arabinose apresentaram, além de complexos com alto peso molecular, duas bandas para atividade de β-glicosidase; uma banda de 48 kDa e outra de 55,6 kDa. Extratos produzidos por C. cubensis crescidos em glicose apresentaram duas bandas de atividades de β-glicosidase, sendo uma banda de 106,8 kDa e outra de 48 kDa. Zimograma contendo xilana birchwood (XB-SDS- PAGE) como substrato, demonstrou que C. cubensis foi capaz de produzir uma xilanase constitutiva de 19 kDa quando crescido em todas as fontes testadas. A metodologia de XB-SDS-PAGE mostrou que C. cubensis foi capaz de produzir uma xilanase constitutiva de 19 kDa, quando crescido em qualquer uma das fontes testadas. Extratos produzidos pelo fungo crescido em farelo de trigo, CMC e xilana Birchwood, apresentaram, no gel de zimograma, uma região bem definida de atividade de xilanase entre 97 e 39 kDa de massa molecular. Locust bean gum e citrus peel foram capazes de induzir a produção de uma xilanase de 37,3 kDa. Xilose induziu a produção de duas xilanases, uma de 53,2 kDa e outra de 47,9 kDa. O extrato produzido pelo fungo crescido em arabinose apresentou um padrão de bandas semelhante ao encontrado no extrato oriundo do crescimento em xilose. Extratos oriundos do crescimento de C. cubensis em glicose, lactose, galactose e manose apresentaram somente a atividade da xilanase expressa constitutivamente de 19 kDa. Zimograma contendo CMC como substrato, demonstrou que apenas em extratos produzidos por C. cubensis crescidos em manose e xilose não foi possível observar atividade de endoglicanase. Farelo de trigo, CMC e xilana Birchwood induziram em C. cubensis a produção de duas endoglicanases, uma de 38 kDa e outra de 55,6 kDa. Quando C. cubensis cresceu em glicose, LBG, CP, lactose, galactose, arabinose e celobiose foi possível visualizar a produção de uma endoglicanase de 38 kDa. Analisando os resultados das atividades enzimáticas juntamente com as análises em zimograma, é patente que fontes complexas como farelo de trigo, CMC e xilana Birchwood, possuem elevado potencial indutor quanto à produção das enzimas envolvidas na sacarificação da biomassa em C. cubensis. Já os extratos produzidos por C. cubensis cultivados em presença de fontes de carbono simples, apesar de não apresentarem, quantitativamente, valores expressivos de atividade de celulases e hemicelulases, apresentaram, de maneira qualitativa, atividades de celulases e hemicelulases quando analisados através de zimogramas. Isto comprova que fontes de carbono simples podem estar envolvidas na ativação da produção tanto de celulases quanto de hemicelulases em C. cubensis.
Resumo inglês:Results obtained recently in our research group (Production and Characterization of biotechnological interest Enzyme) have demonstrated that Chrysoporthe cubensis, fungal pathogen of eucalyptus, has showed potential for producing enzymes involved in saccharification of lignocellulosic biomass. In this work C. cubensis was cultivated in several carbon sources with the view to observe the production of cellulases and hemicellulases. Complex carbon sources such as wheat bran, carboxymethilcellulose CMC, Birchwood xylan XB, Locust bean gum LBG, citrus peel CP and also simpler carbon sources such as glucose, cellobiose, lactose, galactose, mannose, xylose and arabinose were tested as enzymatic activity inducers. C. cubensis produced greater levels of celullolytic and hemicellulolytic activities when added with wheat bran and CMC. When cultivated in wheat bran C. cubensis reached values for β-glucosidase, endoglucanase and xylanase activities of 0,36 U/mL, 3,6 U/mL, 14,2 U/mL, respectively. When cultivated in CMC, C. cubensis produced β-glucosidase, endoglucanase and xylanase activities of 0,48 U/mL, 2,8 U/mL, 10,7 U/mL, respectively. When cultivated in birchwood xylan extracted produced by C. cubensis presented xylanase activity of 9,9 U/mL, however it was not efficient for inducing cellulases. Simpler carbon sources generally presented low inducing capacity in C. cubensis. Zimograms were made with the aim to analize qualitatively the enzymes present in extracts produced by fungus C. cubensis. Zimogram containning fluoorescent substrate of 4-Methylumbelliferyl β-D- glucopyranoside, has demonstrated that C. cubensis was able to produce β-glicosidase activity, when cultivated in all sources of carbon, except in mannose and galactose. Extracts produced by C. cubensis, cultivated in complex sources, presented a β-glucosidase of 55,6 kDa. Presences of possible complexes of high molecular weight, containning β-glucosidase activity were also detected. Among extracts produced in the presence of simpler sources, lactose induced the same group of β-glucosidases as complex sources. Xylose and arabinose also showed activity bands with high molecular weights. Xylose also induced a β-glucosidase of 74 kDa and the arabinose was able to induce the production of a β-glucosidase of 48 kDa and other of 55,6 kDa. Glucose induced a β-glucosidase of 106,8 kDa and other of 48 kDa. Zimogram containing birchwood xylan as substrate, has demonstrated that C. cubensis was able of producing a xylanase constitutive of 19 kDa when added in all sources tested. XB-SDS-PAGE has shown that C. cubensis was able to produce a constitutive xylanase of 19 kDa, when grown in any sources tested. Extracts produced by wheat bran, CMC and birchwood xylan, presented a well defined region activity of xylanase between 97 and 39 kDa. Locust bean gum and citrus peel were able to induce the production of a xylanase of 37,3 kDa. Xylose has induced the production of two xylanases, one of 53,2 kDa and other of 47,9 kDa. The extract produced by the fungus added in arabinose, presented a band standard similar to what is found in the extract from grown in xylose. Glucose, lactose, galactose and mannose showed only the basal activity of 19 kDa xylanase. Zimogram containing CMC as substrate has demonstrated that only extract produced by C. cubensis added in mannose and xylose, it was not possible to observe the activity of endoglucanase. Wheat bran, CMC and Birchwood xylan induced the production of two endoglucanases, one of 38 kDa and other of 55,6 kDa. When C. cubensis grew in glucose, LBG, CP, lactose, galactose, arabinose and cellobiose it was possible to view the production of one endoglucanase of 38 kDa. Analizyng results of enzymatic activities together with zimogram analysis, it is clear that complex sources as wheat bran, CMC and Birchwood xylan have high inducing potential in relation to the production of enzymes involved with biomass scarification. Simpler sources, on the other hand, although they do not present meaningful values of enzymatic activities, may trigger production of cellulases as much as hemicellulases, albeit in discrete level.