Avaliação da expressão em células Vero dos candidatos vacinais pCID2EtD2prM e pCID2EtD3prM de DNA recombinante para o vírus Dengue-2

The dengue viruses have single-stranded, positive polarity RNA genome that encodes proteins in a long open-reading frame (ORF). This genome is about 11 kb-length and responsible by encoding three structural proteins called Capsid (C), membrane (M) and Envelope (E), this last one being a glycoprotein...

Nível de Acesso:openAccess
Publication Date:2009
Main Author: Dutra, Nina Rocha lattes
Orientador/a: Paula, Sérgio Oliveira de lattes
Co-advisor: Neves, Clóvis Andrade lattes, Salcedo, Joaquín Hernán Patarroyo lattes
Banca: Oliveira, Leandro Licursi de lattes, Fietto, Luciano Gomes lattes
Format: Dissertação
Language:por
Published: Universidade Federal de Viçosa
Programa: Mestrado em Biologia Celular e Estrutural
Department: Análises quantitativas e moleculares do Genoma; Biologia das células e dos tecidos
Assuntos em Português:
Assuntos em Inglês:
Áreas de Conhecimento:
Online Access:http://locus.ufv.br/handle/123456789/2352
Citação:DUTRA, Nina Rocha. Evaluation of the expression in Vero cells of the vaccine candidates pCID2EtD2prM and pCID2EtD3prM of recombinant DNA for the Dengue-2 virus. 2009. 89 f. Dissertação (Mestrado em Análises quantitativas e moleculares do Genoma; Biologia das células e dos tecidos) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2009.
Resumo Português:Os dengue vírus são vírus de genoma RNA fita simples polaridade positiva que codifica as proteínas em uma longa open reading frame . Contém aproximadamente 11 kb, responsáveis pela codificação de três proteínas estruturais denominadas Capsidial (C), de Membrana (M), e Envelope (E), sendo esta última uma glicoproteína. Adicionalmente a estas proteínas estruturais, o genoma viral expressa ainda sete proteínas não-estruturais denominadas NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, e NS5. Estes vírus pertencem à família Flaviviridae, sendo os patógenos humanos de maior importância desta família. São transmitidos através do mosquito Aedes aegypti, causando a dengue. As manifestações da dengue variam desde infecções assintomáticas até quadros graves de doença hemorrágica que são responsáveis pelos altos índices de morbidade e mortalidade. Ainda não há terapia antiviral específica.Vários pesquisadores têm se lançado à busca de uma vacina eficaz para o controle da dengue, e consequentemente, diversas estratégias têm sido levantadas para a produção da mesma, lançando mão de desde métodos clássicos como atenuação viral até a expressão de antígenos recombinantes em vetores de expressão, tais como vírus e bactérias. No entanto, os resultados obtidos no desenvolvimento destas vacinas têm frustrado a comunidade científica mundial. Uma nova estratégia vacinal, a vacina de DNA, está atualmente sob intensa investigação. Neste contexto, foi construído um candidato vacinal contra o dengue, utilizando-se para tanto um plasmídeo pCI Vector expressando a proteína E truncada do vírus dengue-2, sem a expressão concomitante de prM, com a finalidade de reduzir o tamanho do inserto a ser clonado, facilitando a produção de uma vacina tetravalente em um único plasmídeo. Testes demonstraram que a proteína E truncada foi corretamente expressa pelo plasmídeo, porém em quantidade reduzida e que existe uma boa resposta específica contra o vírus da dengue gerada pelo clone recombinante, mas apenas uma pequena porcentagem de camundongos imunizados com o plasmídeo foi protegida quando desafiados com vírus dengue-2. Estes resultados justificam a busca de um aprimoramento deste candidato vacinal contra o dengue-2, a fim de aumentar a expressão da proteína E clonada no plasmídeo vacinal e assim proporcionar uma imunização mais eficaz. O presente trabalho visa o aprimoramento desse plasmídeo através da inserção das proteínas prM/DENV-2 e prM/DENV-3, a fim de verificar se a presença de prM na construção vacinal aumentaria a expressão de E. Os novos plasmídeos recombinantes contruídos foram denominados pCID2EtD2prM e pCID2EtD3prM. Os resultados obtidos provaram a correta clonagem e expressão das proteínas prM/E por células Vero transfectadas, e indicam que houve um aumento de expressão relativo de 67,02% por pCID2EtD3prM com relação a pCID2EtD2prM, resultados esses que ainda deverão ser corroborados por testes absolutos.
Resumo inglês:The dengue viruses have single-stranded, positive polarity RNA genome that encodes proteins in a long open-reading frame (ORF). This genome is about 11 kb-length and responsible by encoding three structural proteins called Capsid (C), membrane (M) and Envelope (E), this last one being a glycoprotein. In addition to these proteins, the viral genome expresses seven other nonstructural proteins called NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b and NS5. The dengue viruses belong to the Flaviviridae family, and are the most important human pathogens of this family. They are transmitted by the bite of the Aedes aegypti mosquito, leading to the dengue disease. The manifestations of this disease vary from asymptomatic infections until severe hemorrhagic features which are responsible by the high morbidity and mortality rates of dengue. So far, there is not specific antiviral treatment. Many researchers have been working on the quest for an efficient dengue vaccine, and consequently, various strategies have been brought to view for its production, using simpler methods, such as the viral attenuation, as well as more complex ones, such as the expression of recombinant antigens in expression vectors, like viruses and bacteria. However, the results obtained in the developmente of these vaccines have been frustrating the world scientific community. A new vaccine strategy, the DNA vaccine, is currently under intense investigation. In this context, a vaccinal candidate for the dengue-2 virus (DENV-2) has been constructed utilizing the pCI plasmid vector expressing the truncated E protein from DENV- 2, without the concomitant expression of prM, aiming the size reduction of the insert to be cloned, facilitating the production of a tetravalent vaccine in a single plasmid vector. The testing demonstrated that the truncated E protein was correctly expressed by the plasmid, but in reduced quantity, and that a good specific response existed against the dengue-2 virus generated by the recombinant clone, but only a small percentage of the immunized mice was protected when challenged with DENV-2. These results justify the search for the improvement of this vaccine candidate against DENV-2, with the objective of increasing the expression of the E protein cloned into the vaccine plasmid, thus offering more efficient immunization.This present work aims the improvement of this plasmid by the insertion of the prM/DENV-2 and prM/DENV-3 proteins, to verify if the presence of these proteins in the vaccine construction would increase the expression of E. The new plasmids constructed were called pCID2EtD2prM and pCID2EtD3prM. The results achieved proved the correct cloning and expression of prM/E by transfected Vero cells, and indicated that there was a relative expression increase of 67,02% by pCID2EtD3prM in relation to pCID2EtD2prM, results that are still to be corroborated by absolute tests.