Desenvolvimento e caracterização de anticorpos monoclonais contra um novo arbovírus e sua aplicabilidade no diagnóstico e estudo de interações em mosquitos vetores - Coelho, Gabriela Mattoso (2020)
Referência para o Ministério da Saúde na região Sul do país, o Laboratório de Virologia Molecular do Instituto Carlos Chagas/Fiocruz PR tem entre suas atribuições a vigilância epidemiológica de vírus emergentes e reemergentes. Neste contexto, recentemente identificou e caracterizou um novo alphavirus, denominado Caaingua (CAAV). A maior parte dos vírus desse gênero possuem insetos como vetores, majoritariamente mosquitos, e infectam uma grande variedade de hospedeiros vertebrados. Os alphavirus que incluem humanos como hospedeiros em seus ciclos de transmissão podem causar doenças, tipicamente caracterizadas por artralgia ou encefalite. O CAAV foi isolado a partir de pools de mosquitos Culex na região de Marilena (PR) durante um surto de doença artritogênica, a qual não teve diagnóstico laboratorial confirmado para nenhuma arbovirose circulante e foi, portanto, descrita como desconhecida. Apesar de até o momento não ter sido estabelecido um vínculo entre o vírus e o surto em Marilena, maiores estudos são necessários para investigar o papel epidemiológico do novo vírus e seu ciclo de transmissão. Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi desenvolver insumos para ampliar a caracterização de CAAV in vitro e em mosquitos. Os objetivos específicos do estudo foram o desenvolvimento e caracterização de anticorpos monoclonais (mAbs) reativos contra o vírus e a avaliação da infecção de CAAV em mosquitos Aedes albopictus por RT-qPCR. Para atingir esses objetivos, camundongos Balb/C foram imunizados com o vírus purificado e seus esplenócitos foram fusionados com células de mieloma da linhagem P3X63Ag8.653. Os hibridomas secretores de anticorpos anti-CAAV foram selecionados por imunofluorescência indireta e os positivos foram submetidos a diluição limitante para obtenção de mAbs. O protocolo de fusão resultou em três hibridomas (8A11, 7D11 e 5F4) estáveis produtores de anticorpos anti-CAAV, dos quais foram obtidos 15 mAbs. Dois mAbs (5F4/F6/A10 e 5F4/H6/D6) foram purificados e caracterizados, sendo ambos do isotipo IgG2a com cadeia leve kappa. Os mAbs não apresentaram reatividade cruzada com os alphavirus Aura virus, Chikungunya, vírus da Encefalite Equina Venezuelana e Mayaro e continuaram reativos contra o CAAV após a purificação. Ademais, o mAb 5F4/F6/A10 teve sua aplicabilidade em ensaio de citometria de fluxo demonstrada e apresentou desempenho semelhante ao anticorpo comercial usado como controle. Para avaliar a infecção por CAAV em A. albopictus, mosquitos dessa espécie foram infectados por via oral em dois experimentos: no primeiro, os mosquitos foram coletados e analisados individualmente após 0, 4, 7, 14 e 21 dias e, no segundo, os mosquitos foram coletados após 0, 7, 14 e 21 dias, foram dissecados em intestino, tórax e cabeça e analisados em pools. As análises por RT-qPCR sugerem que mosquitos A. albopictus são suscetíveis à infecção por CAAV e que a replicação não se limita ao intestino, mas também se dissemina para cabeça e tórax em até 7 dias após a ingestão do vírus. Em ambos os experimentos, houve detecção viral nos mosquitos até 21 dias após a alimentação, sugerindo uma infecção persistente. Esse foi o primeiro estudo a avaliar a infecção por CAAV em espécies de mosquitos vetores e a produzir mAbs específicos para CAAV.