tRNA ligase (Trl1) -like de Trypanosoma brucei: efeitos do RNAi in vivo

• Ano de defesa: 2012
• Autor(a) principal: Bruno, Roberta Eitler
• Orientador(a): Polycarpo, Carla Ribeiro
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Link de acesso: https://arca.fiocruz.br/handle/icict/61843
• topic: Trypanosoma brucei; tRNA ligase; Editoração de tRNA

Doenças neligenciadas são definidas como um grupo de doenças infecciosas crônicas relacionadas com a pobreza que ocorrem principalmente em populações da América Latina, África e Ásia. Entre elas estão a Doença de Chagas, Doença do Sono e Leishmaniose, transmitidas por insetos e causadas pelos protozoários Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei e Leishmania sp., respectivamente. Em busca de conhecimento básico sobre a biologia do tRNA destes tripanossomatídeos e prevendo a possibilidade de descoberta de novos alvos terapêuticos foi estudado o pouco conhecido mecanismo de editoração de tRNAs em tripanossomatídeos. Dentre as enzimas envolvidas na maturação de tRNAs, estão as tRNA ligases, que efetuam a ligação dos éxons gerados após retirada do íntron pela ação de uma tRNA endonuclease. O produto do gene da putativa tRNA ligase dos tripanossomatídeos (trl1-like) não possui homologia com o gene da tRNA ligase humana, sendo um promissor alvo para droga. O gene trl1 (tRNA ligase) é essencial para a levedura S. cerevisiae, dessa forma, esse trabalho procurou caracterizar funcionalmente a tRNA ligase de tripanossomatídeos, analisando os domínios da enzima dos parasitos, investigando a essencialidade do gene trl1-like em T. brucei e observando a atividade da enzima de T. brucei in vitro. O alinhamento das sequências da tRNA ligase de classe I de tripanossomatídeos e leveduras confirmou que as sequências tratam-se de tRNA ligases, apresentando os três domínios: ligase, polinucleotídeo quinase e fosfodiesterase cíclica assim como os motivos conservados essenciais para o funcionamento da enzima. Para os ensaios in vivo, foi construído o plasmídeo pLew100-trl1-2 e transfectado em T. brucei procíclicos, para os ensaios de RNAi. Durante a indução do RNAi pode-se observar a inibição do crescimento do T. brucei, sempre a partir do quarto dia de indução. No entanto, nenhuma alteração no ciclo celular e na viabilidade dos parasitos foi verificada. O silenciamento gênico foi confirmado por qPCR, demonstrando diminuição da expressão do mRNA a partir de 48 h de indução. A enzima Trl1-like foi expressa e purificada in vitro sob diversas condições experimentais, no entanto não foi possível testar sua atividade devido a sua instabilidade in vitro. Esse trabalho permitiu demonstrar a importância da Trl1-like para a sobrevivência do T. brucei contribuindo para um maior entendimento da biologia dos tripanossomatídeos.