Avaliação da sensibilidade da técnica de PCR para diagnóstico da esporotricose felina e canina em peles emblocadas em parafina - Luiz, Raul Leal Faria (2021)
A esporotricose é uma micose granulomatosa crônica, cosmopolita, que acomete humanos e animais. A infecção é causada por fungos dimórficos do complexo Sporothrix schenckii. No Brasil, o Rio de Janeiro é considerado área hiperendêmica de esporotricose causada por S. brasiliensis associada à transmissão zoonótica felina. O método padrão de referência para o diagnóstico de esporotricose é a caracterização microscópica do patógeno isolado em cultura, porém essa metodologia é demorada. Caso a cultura micológica não seja possível, as amostras clínicas podem ser previamente fixadas em formalina tamponada a 10% e emblocadas em parafina (FFEP). Métodos moleculares, como a reação em cadeia da polimerase (PCR) para detecção das sequências de DNA fúngico, também podem ser utilizados para o diagnóstico por serem rápidos, sensíveis e espécie-específicos e, além disso, podem ser aplicados em amostras frescas e FFEP. Não existe até o momento um protocolo estabelecido para a extração de DNA do fungo Sporothrix spp. em amostras FFEP de esporotricose felina e canina, assim como não existe ainda uma metodologia padronizada e reprodutível para realização da PCR para o diagnóstico definitivo da esporotricose felina e canina a partir de tecidos FFEP. O presente trabalho tem como objetivo avaliar a sensibilidade de duas técnicas de PCR para o diagnóstico de esporotricose felina e canina, em nível de gênero, em tecidos FFEP. Foram utilizadas seis espécies diferentes de Sporothrix (S. chilensis, S. mexicana, S. pallida, S. globosa, S. brasiliensis e S. schenckii) de pellets obtidos por centrifugação de cultura micológica e FFEP para padronização da metodologia de extração e identificação molecular Foram também utilizadas 14 amostras de peles de gatos e 20 amostras de peles de cães atendidos no Laboratório de Pesquisa Clínica em Dermatozoonoses em Animais Domésticos (LAPCLINDERMZOO), Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas, no período de 2009 a 2019, cujo diagnóstico de esporotricose foi confirmado por cultura micológica para validação das metodologias. Neste estudo, as amostras FFEP foram submetidas a dois protocolos de cortes histológicos: (1) 8 cortes de 5 µm de espessura; e (2) um corte de 16 µm de espessura, e à extração de DNA de Sporothrix spp. utilizando dois kits comercias para tecidos FFEP (extração química e térmica), sendo os mesmos validados no presente estudo. O DNA extraído foi utilizado para identificação molecular pela técnica da nested PCR, em nível de gênero de Sporothrix spp., para o diagnóstico da esporotricose felina e canina em tecidos FFEP baseada na amplificação para a região 18S do RNA ribossomal (ITS). O protocolo de extração química utilizando o protocolo de 8 cortes histológicos de 5 µm de espessura apresentou melhor desempenho. O ensaio da nested PCR, utilizando primers específicos para o gênero Sporothrix, apresentou alta sensibilidade e especificidade para identificar esse fungo em amostras FFEP de pellets de cultura micológicas. As metodologias de extração de DNA e da nested PCR utilizadas apresentam grande potencial para serem aplicadas no diagnóstico da esporotricose felina e canina em amostras FFEP na rotina clínica