Caracterização molecular de Klebsiella pneumoniae produtoras de carbapenemases do tipo KPC-2, NDM-1 e OXA-370 isoladas no Brasil - Pereira, Polyana Silva (2016)
Klebsiella pneumoniae multirresistentes produtoras de carbapenemases do tipo KPC, NDM e OXA-48-like envolvidas em infeções hospitalares são atualmente um grande problema de saúde pública em diferentes partes do mundo. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi realizar a caracterização molecular de 66 amostras de Klebsiella pneumoniae produtoras de KPC, NDM e OXA-48-like provenientes de diferentes estados brasileiros, obtidas de diferentes materiais clínicos, no período entre 2010 a 2014. A confirmação da produção de carbapenemases, identificação da variante alélica e avaliação do ambiente genético foram realizadas por PCR e sequenciamento. A susceptibilidade aos antimicrobianos foi determinada através de difusão em ágar (CLSI, 2015) e determinação da CIM por Etest® (Nota Técnica N°1/2013 ANVISA). Foi realizada pesquisa através de PCR para genes de resistência a beta-lactâmicos, aminoglicosídeos e quinolonas, bem como pesquisa de genes de virulência. Para análise epidemiológica, PFGE e MLST foram utilizados. A identificação do plasmídio carreador do gene codificador de carbepenemases foi realizada através de extração plasmidial e hibridização. O sequenciamento genômico foi realizado em 11 amostras selecionadas para investigação da presença e o ambiente genético de genes de resistência, genes de virulência, bem como realização de análise da relação filogenética entre as amostras estudadas. As variantes genéticas dos genes codificadores de carbapenemases foram blaKPC-2, blaNDM-1 e blaOXA-370. Observamos o fenótipo de multirresistência em todas as amostras incluídas no estudo, sendo dez amostras resistentes a oito das nove classes de antimicrobianos testadas Genes adquiridos codificadores de resistência a beta-lactâmicos, aminoglicosídeos, quinolonas, fosfomicinas, sulfonamidas, macrolídeos, fenicóis, tetraciclinas, rifampicinas e trimetoprima foram encontrados através de PCR e sequenciamento genômico. Além dos genes de resistência adquiridos, observamos mutações em genes relacionados à resistência a quinolonas (gyrA, parC, parE, oqxR), tigeciclina (ramR e acrR), e mutações nas porinas OmpK35 e OmpK36 através do sequenciamento genômico, demonstrando o grande aresenal e a grande capacidade de aquisição de diferentes mecanismos de resistência entre as amostras. Não observamos, através do PCR ou sequenciamento genômico, os principais fatores de virulência associados às amostras hipervirulentas, como magA (wzyKPK1), rmpA, rmpA2, sendo detectados na maioria das amostras genes associados à adesão e sobrevivência bacteriana, como produção de fimbrias e adesinas (mrkD = 96,9%; fimH=100%; ycfm = 100%) e transporte de sideróforos (entB=100%). Nas amostras positivas para blaKPC-2 encontramos a estrutura completa do Tn4401 isoforma b em 84,3% das amostras. Observamos o gene blaKPC-2 associado a um mesmo plasmídio de 40kb em 41,9% das amostras, que apresentou estrutura genética similar a um plasmídio já descrito na literatura. Nas amostras positivas para blaNDM-1 observamos, em todas, a associação do gene blaNDM-1 com ISAba125 e bleMBL, e através do sequenciamento genômico, observamos a estrutura completa do Tn3000. O gene blaOXA-370 foi encontrado em plasmídios de 25kb (duas amostras), 50 kb e 117kb, sendo observado flanqueado upstream por uma transposase Tn3 truncada por IS5075-like e downstream por uma transposase Tn4 truncada por IS15-like nas amostras sequenciadas Observamos 30 grupos clonais por PFGE e 27 sequence types, com destaque para os grupos KPC_A/ST437; KPC_C/ST11 e KPC_Q/ST340 nas amostras positivas para blaKPC-2, pertencentes ao Complexo Clonal 11 (CC11), mundialmente associado à dispersão dessa carbapenemase. Nas amostras positivas para blaNDM-1 e blaOXA-370 os grupos clonais mais observados foram NDM_A/ST37 (41,6%) e OXA-370_A/ST16 (95,4%) respectivamente. A análise filogenética a partir do genoma corroborou os agrupamentos realizados através de MLST. Principalmente nas amostras do CC11 positivas para blaKPC-2 e nas amostras do ST16 positivas para blaOXA-370 observamos o acúmulo de mutações associadas a genes de resistência e nas porinas. Acreditamos que estas mutações podem contribuir para o fenótipo de resistência e consequentemente, auxiliar no sucesso desses clones prevalentes. Este estudo alerta para a presença de amostras multirresistentes produtoras de carbapenemases em nosso país carreando um grande arsenal de genes de resistência adquirida associados a elementos genéticos moveis, mas também apresentando mutações associadas à resistência e carreando alguns genes de virulência, fato preocupante devido às limitações para tratamento