Polimorfismos responsáveis pela resistência a benzimidazóis em populações de Haemonchus contortus isoladas no estado do Ceará. - SANTOS, J. M. L. dos (2013)
Resumo: Haemonchus contortus é o nematóide mais prevalente na região Nordeste do Brasil. O seu controle é baseado na utilização de benzimidazóis de forma generalizada e o uso inadequado acelera a seleção de parasitos resistentes. Métodos fenotípicos, tais como, o teste de redução na contagem de ovos nas fezes (FECRT) e o teste de eclosão de ovos (TEO) são amplamente utilizados para caracterizar a resistência anti-helmíntica (RA), embora com baixa sensibilidade. Os métodos baseados na reação em cadeia pela polimerase (PCR) são também utilizados para diagnosticar a resistência a benzimidazóis em H. contortus. Estes métodos detectam polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) F200Y, F167Y e E198A no gene codificante para o isotipo 1 da ?-tubulina, que são conhecidos por estarem associados à resistência a benzimidazóis. O objetivo deste estudo foi investigar a presença de polimorfismos responsáveis pela resistência a benzimidazóis em populações de Haemonchus contortus isoladas no estado do Ceará. A PCR em tempo real (qPCR) foi realizada para identificação de cada SNP conhecido no gene codificante para o isotipo 1 da ?-tubulina, para tanto foi utilizado DNA de um pool de 10 adultos de H. contortus do sexo masculino obtidos de um animal por rebanho. O FECRT e o TEO foram usados para determinar a resistência original presente na população. As amostras testadas foram obtidas a partir de 6 fazendas localizadas em 5 municípios do estado do Ceará (Nordeste do Brasil): Tauá (TA1 e TA2), Boa Viagem (BV), Quixadá (QX), Santa Quitéria (SQ) e Solonópole (SO). O isolado inbredsusceptible-Edinburgh (ISE), previamente caracterizado como susceptível a benzimidazóis, foi utilizado como referência para fins de comparação na qPCR. A resistência a benzimidazóis foi detectada no FECRT em todas as fazendas com valores que variam de 0 a 50% de redução de OPG. Os valores das concentrações inibitórias de 50% da eclosão das larvas (CE50) determinados no TEO foram todos superiores a 1,62 µg/mL. Nos resultados da qPCR foram observadas altas frequências dos SNP F200Y e F167Y. As maiores frequências de alelos resistentes nas populações estudadas foram para o SNP F167Y e não foram detectados alelos resistentes para o SNP E198A. As frequências de alelos resistentes para o isolado ISE foram 1,7%, 0% e 0% para os SNP F200Y, F167Y e E198A, respectivamente. Os resultados sugerem que os SNP F167Y e F200Y são importantes para a resistência a benzimidazóis nas populações estudadas e devem ser incluídos no diagnóstico molecular de resistência anti-helmíntica no Ceará. Abstract: Haemonchus contortus is the most prevalent nematode in Northeast Brazil. Control based on benzimidazole utilization is widespread and its inadequate use accelerates the selection of resistant parasites. Phenotypic methods such as faecal egg count reduction test (FECRT) and egg hatch assay (EHA) are widely used to characterize anthelmintic resistance (AR) albeit with low sensitivity. PCR based methods are also used to diagnose resistance to benzimidazoles in H. contortus. These methods detect single nucleotide polymorphisms (SNPs) F200Y, F167Y and E198A in the -tubulin isotype 1 gene that are known to be associated with benzimidazole resistance. The objective of this study was to investigate the presence of polymorphisms responsible for resistance to benzimidazoles in Haemonchus contortus populations isolated in the state of Ceará. Real time (qPCR) was performed to identify each known SNP in the ?-tubulin isotype 1 gene. DNA was extracted from a pool of 10 adult male H. contortus from a single animal per farm. FECRT and EHA were used to determine the original resistance present in the population. Tested samples were obtained from 6 farms located in 5 counties in the Ceará State (Northeast Brazil): Tauá (TA1 and TA2), Boa Viagem (BV), Quixadá (QX), Santa Quitéria (SQ) and Solonópole (SO). The inbred-susceptible-Edinburgh (ISE) isolate, previously reported as benzimidazole susceptible, was used as reference for comparison purposes in the qPCR assay. Benzimidazole resistance was detected by FECRT in all farms with values ranging from 0 to 50%. Half maximal effective concentration (EC50) values as determined by EHA were all above 1.62 µg/mL. Real-time PCR results showed high frequencies of the SNPs F200Y and F167Y. The most frequent resistant allele in the studied populations was SNP F167Y and resistance for SNP E198A was not detected. Resistant allele frequencies for the ISE isolate were 1.7%, 0% and 0% for SNPs F200Y, F167Y and E198A, respectively. Our results suggest that the SNPs F167Y and F200Y are both important for benzimidazole resistance in the studied populations and should be included in the molecular diagnosis of anthelmintic resistance in the Ceará.