Desenvolvimento de um ensaio imunoenzimático (ELISA) para diagnóstico de Linfadenite caseosa em ovinos e caprinos. - GONÇALVES, A. N. D. (2017)
A Linfadenite Caseosa (LC) é uma doença infectocontagiosa, causada pela bactéria Corynebacterium pseudotuberculosis e que acomete ovinos e caprinos. Esta doença é caracterizada por lesões purulentas e caseosas nos gânglios linfáticos e, ocasionalmente, pulmões, baço, rins e fígado. O diagnóstico da LC, normalmente, é baseado em sinais clínicos, no entanto, o teste padrão ouro é o isolamento microbiológico, realizado a partir do material purulento dos abcessos. Faz-se necessário um método que seja capaz de diagnosticar animais doentes, com presença ou não de abcessos externos. Neste contexto, visto os esforços para identificar e controlar a doença, objetivou-se, neste estudo, avaliar o potencial da proteína XA1 recombinante (XA1r) de C. pseudotuberculosis como candidata a compor um teste sorológico do tipo ELISA indireto, para o diagnóstico de linfadenite caseosa em ovinos e caprinos. A sequência do gene xa1, que codifica a porção hidrofílica da proteína XA1, foi selecionada com o auxílio do programa Protean (DNASTAR®). Esta sequência e a construção do plasmídeo de expressão gênica foram sinteticamente confeccionadas pela empresa de biotecnologia Genone Biotechnologies. O gene xa1 foi clonado em plasmídeo de expressão em procariotos pET-47b(+). O plasmídeo pet47Bxa1 foi introduzido em célula quimicamente competente de E. coli Rosetta-Gami e realizada a expressão gênica XA1r foi purificada por cromatografia de afinidade, em resina metálica com a coluna de agarose níquel, dialisada em PBS, quantificada pelo método de Lowry e armazenada a -20ºC. Posteriormente, um teste de ELISA indireto foi padronizado com o uso desta proteína como antígeno sistemático (n= 23), assintomáticos (n= 10) e histórico de LC (n= 10). O banco formado com soros de caprinos foi composto por soros positivos (n=29), negativos (n=19), soros de animais de um rebanho com histórico de LC (n= 15) e outros soros de caprinos com sinais clínicos da doença (n= 29), totalizando 92 soros. O ponto de corte foi feito por meio da curva ROC. O teste de ELISA indireto foi capaz de discriminar animais positivos e negativos, com sensibilidade de 90,9% e especificidade de 72,2%. Foram identificados cinco animais como falso-positivos e três foram considerados falso-negativos. Quando testados os animais dos três grupos - testes assintomáticos, histórico de LC e controle sistemático -, 90,7% foi considerado positivo para LC. O teste de ELISA indireto para diagnóstico de LC em caprinos apresentou sensibilidade de 96,6% e especificidade de 67,2%. O teste de ELISA apresentou um animal falso-negativo e seis falso-positivos. A associação do teste de ELISA indireto, proposto a exames clínicos, foi capaz de diagnosticar como positivos 96,55% dos animais que possuíam sinal clínico da doença, mostrando assim, o potencial da proteína XA1r no reconhecimento de anticorpos contra C. pseudotuberculosis. Os resultados demonstram a potencialidade da proteína XA1r, quando utilizada como antígeno em teste ELISA indireto. Deste modo, este imunoensaio poderá ser utilizado para o diagnóstico de ovinos e caprinos com LC, auxiliando no controle da doença.