Padronização da RT-PCR em tempo real trioplex para detecção dos vírus Zika, Dengue e Chikungunya - Borges, Gleissy Adriane Lima (2022)
As principais arboviroses prevalentes nas Américas, representam grande impacto na saúde pública com aumento progressivo de endemicidade em diversos continentes, nos últimos anos. Os principais agentes são representados pelos vírus Dengue (DENV), Zika (ZIKV) e Chikungunya (CHIKV) que compartilham o mesmo vetor, principalmente o mosquito A. aegypti. As condições favoráveis geoclimáticas e a biodiversidade contribuem para manutenção do ciclo natural dos vetores destes agentes, favorecendo as adaptações a novos ambientes que facilitam a introdução e dispersão de doenças emergentes e reemergentes, principalmente quando associada pelo aumento dos deslocamentos populacionais nacionais, internacionais, transitórios ou permanentes. Os sinais e sintomas semelhantes nos primeiros dias da doença dificultam o diagnóstico clínico e reforçando a necessidade de teste laboratoriais cada vez mais sensíveis, específicos e rápidos que identifiquem os agentes virais e descartem outros. O estudo padronizou um sistema trioplex pela metodologia de RT-PCR em tempo real, para detecção de DENV, ZIKV e CHIKV, em uma única reação. A clonagem dos RNAs sintéticos foi realizada com intuito de obter precisão e exatidão os parâmetros. Os pares dos oligonucleotídeos iniciadores e sondas desenhados foram sensíveis e específicos à sequência alvo dos vírus. A otimização das condições de concentrações ideais para as reações foi fixada em 500/500nM para os iniciadores e em 200nM para as sondas. Comprovou-se a eficiência do protocolo RT-qPCR trioplex, através da comparação com o singleplex, obtendo-se resultados satisfatórios quanto ao valor da eficiência de 94,853 a 95,672% e o R2 (coeficiente de linearidade) entre 0,996 a 1. A sensibilidade analítica do sistema trioplex, foi baseada a partir da quantificação de controles padrões, para análise do alcance dos limites de detecção e quantificação do protocolo RT-qPCR, obteve-se os números de cópias por reação de 138,80; 56,65 e 62,06, respectivamente para DENV, ZIKV e CHIKV, com 95% de intervalo de confiança. A especificidade do novo protocolo foi testada a partir de um painel viral para mais nove diferentes agentes, alcançando 100% de especificidade, apresentando curva de amplificação de alta eficiência para os controles positivos e sem amplificação para os controles negativos com ausências de reações cruzadas. As comparações de acurácia foram realizadas a partir das análises de 214 RNAs conservados a -70 ºC, arquivadas no acervo laboratorial, obtidos de amostras (soro) das rotinas, com percentuais de concordância de 98%, 95% e 100%, respectivamente para os vírus DENV, ZIKV e CHIKV, quando comparados ao ensaio padrão. Portanto o protocolo RT-qPCR trioplex desenvolvido neste estudo obteve 98% de sensibilidade, 100% de especificidade, 100% de valor preditivo positivo e 96% de valor preditivo negativo com acurácia de 99%, mostrando-se específico, sensível e capaz de gerar resultados céleres, tornando-o um poderoso instrumento em aplicações de diagnóstico. Logo, o método pode ser ampliando e aplicado em laboratórios de saúde pública contribuindo desta forma na identificação segura e mais rápida, auxiliando ações das vigilâncias epidemiológicas, dos principais agentes das arboviroses.