Purificação, caracterização química e atividade de proteases e inibidores de proteases durante a germinação e em eventos pré e pós-germinativos de sementes de Parkia multijuga - Chevreuil, Larissa Ramos (2013)
Durante a germinação das sementes, proteínas de reserva são acumuladas e degradadas para dar suporte aos principais eventos metabólicos envolvidos na construção de novas células e tecidos. A mobilização proteica ocorre a partir da atividade de proteases e, pode ser controlada por inibidores de proteases, evitando a hidrólise prematura das proteínas de reserva. O objetivo desta pesquisa foi investigar a atividade de proteases e inibidores de proteases durante a germinação e em períodos pré e pós-germinativos de sementes de Parkia multijuga, bem como purificar inibidores de tripsina. Para tanto, as sementes, após quebra da dormência, foram semeadas em bandejas plásticas contendo vermiculita e acondionadas em câmaras de germinação à 25ºC. Os estádios de coleta foram: sementes quiescentes (SQ), após 24 h de embebição (EM), emissão da radícula (RA), expansão do nó cotiledonar (NO) e emissão da parte aérea (PA). As proteínas foram extraídas em NaCl 0,15 M. As atividades de serinoproteases e de inibidores de tripsina e quimotripsina foram avaliadas utilizando-se como substratos o BAPNA e a azocaseína e, a atividade das cisteínoproteases e de inibidores de papaína e bromelaína, utilizando-se o BANA e azocaseína, respectivamente. Os inibidores de tripsina foram purificados a partir de cromatografias em tripsina-Sepharose 4B e HiTrap DEAE FF. O monitoramento da purificação e da mobilização das proteínas foi realizado por meio eletroforeses em SDS-PAGE e géis 2D. Durante a germinação das sementes de P. multijuga observou-se decréscimo expressivo no conteúdo de proteínas após RA, permanecendo até PA, sendo confirmado por géis 2D, demonstrando a degradação de proteínas na faixa de 35 a 75 kDa durante PA, ao passo que, proteínas de 9 kDa foram sintetizadas durante EM. Quanto às atividades inibitórias, verificou-se estabilidade na inibição das serinoproteases em todos os estádios estudados, sendo a atividade anti-tríptica vinte vezes maior quando comparada à da quimotripsina. A inibição de cisteínoproteases foi mais variável, verificando-se máxima inibição da papaína e da bromelaína em EM e NO, respectivamente. As atividades de serino e cisteínoproteases apresentaram-se constantes até NO, com acréscimo em PA. A purificação dos inibidores de tripsina envolveu duas etapas cromatográficas, onde os perfis obtidos foram similares em todos os estádios estudados, indicando a purificação das mesmas moléculas ou de isoinibidores nos diferentes estádios estudados. A partir da purificação dos inibidores de tripsina (PmTI1 e PmTI2) de SQ, essas proteínas foram caracterizadas por apresentarem especificidade inibitória contra a tripsina, alta estabilidade quanto à variação de temperatura e pH e, homologia à sequência de aminoácidos de inibidores do tipo Bowman-Birk de outras espécies de Fabaceae. Neste sentido, inibidores de serino e cisteínoproteases devem participar da regulação da atividade de proteases durante a germinação e nos eventos pré e pós-germinativos de sementes de P. multijuga, estando os inibidores de tripsina do tipo Bowman-Birk presentes durante todo o processo de formação da plântula.