Prospecção de enoil-redutases alternativas em Mycobacterium tuberculosis

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2022
Autor(a) principal: Hopf, Fernanda Souza Macchi lattes
Orientador(a): Bizzarro, Cristiano Valim lattes
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Tese
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
Programa de Pós-Graduação: Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Departamento: Escola de Ciências Saúde e da Vida
País: Brasil
Palavras-chave em Português:
Área do conhecimento CNPq:
Link de acesso: https://tede2.pucrs.br/tede2/handle/tede/10338
Resumo: The latest data published by World Health Organization on tuberculosis in 2021 are more alarming than the previous, revealing a notable reduction in case reports and disease treatment, allied with the increase in number of deaths, related to COVID-19 advent and the control efforts. Despite having effective treatment, tuberculosis remains a major concern, once there is diversity in resistant strains and people which have latent tuberculosis acting as disease reservoirs. Resistance mechanisms are widely studied for drug development strategies. The compound triclosan has its resistance mechanism elucidated and the relation with different enoyl-reductases subtypes described. In order to understand the pathogen’s biology, we sought to prospect possible alternative enoyl-reductases to InhA in Mycobacterium tuberculosis. The chapter 1 of this thesis is presented as a manuscript published on Frontiers in Microbiology, a review about the diversity in enoyl-reductases, organisms which possess it and their role in fatty acids synthesis. The next chapter, structured as a second manuscript, reports analysis concerning the proteins encoded by three of M. tuberculosis genes (Rv3553, Rv0021 and Rv1533), which demonstrated to be highly similar structurally to Streptococcus pneumoniae FabK proteins (SpFabK), which belongs to an alternative family of enoyl-reductases than the one which M. tuberculosis InhA belongs. For each gene, the structural modifications present in the regions corresponding to the SpFabK active site are described. Moreover, it is presented, for each gene, its vulnerability utilizing the gene silencing CRISPR interference technique, their ability to infect macrophage murine cells and the minimum inhibitory concentration for triclosan and isoniazid. Only the silencing of Rv1533 gene disturbed the growth of the bacillus under the tested conditions. Still in chapter 2, it is presented the coexpression networks for Rv3553 and Rv484 and, based on public available RNA-Seq data, the analysis of differential expression of the tree genes under different culture conditions from those experimentally studied. The obtained results reveal that Rv3553, Rv0021c and Rv1533 genes present distinct expression patterns from those found for inhA gene. At the end of chapter 2, based on differential expression patterns, considerations are made about the potential of the Rv1533 gene to act as an alternative enoyl-reductase under starvation conditions. Lastly, in chapter 3, partial results are added: essentiality data for Rv1533 gene, minimum inhibitory concentration for triclosan and isoniazid and messenger RNA quantification in silencing genes strains. Finally, the final considerations and perspectives to this study are described.
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In order to understand the pathogen’s biology, we sought to prospect possible alternative enoyl-reductases to InhA in Mycobacterium tuberculosis. The chapter 1 of this thesis is presented as a manuscript published on Frontiers in Microbiology, a review about the diversity in enoyl-reductases, organisms which possess it and their role in fatty acids synthesis. The next chapter, structured as a second manuscript, reports analysis concerning the proteins encoded by three of M. tuberculosis genes (Rv3553, Rv0021 and Rv1533), which demonstrated to be highly similar structurally to Streptococcus pneumoniae FabK proteins (SpFabK), which belongs to an alternative family of enoyl-reductases than the one which M. tuberculosis InhA belongs. For each gene, the structural modifications present in the regions corresponding to the SpFabK active site are described. Moreover, it is presented, for each gene, its vulnerability utilizing the gene silencing CRISPR interference technique, their ability to infect macrophage murine cells and the minimum inhibitory concentration for triclosan and isoniazid. Only the silencing of Rv1533 gene disturbed the growth of the bacillus under the tested conditions. Still in chapter 2, it is presented the coexpression networks for Rv3553 and Rv484 and, based on public available RNA-Seq data, the analysis of differential expression of the tree genes under different culture conditions from those experimentally studied. The obtained results reveal that Rv3553, Rv0021c and Rv1533 genes present distinct expression patterns from those found for inhA gene. At the end of chapter 2, based on differential expression patterns, considerations are made about the potential of the Rv1533 gene to act as an alternative enoyl-reductase under starvation conditions. Lastly, in chapter 3, partial results are added: essentiality data for Rv1533 gene, minimum inhibitory concentration for triclosan and isoniazid and messenger RNA quantification in silencing genes strains. Finally, the final considerations and perspectives to this study are described.Os últimos dados divulgados em 2021 pela Organização Mundial da Saúde em relação à tuberculose são ainda mais alarmantes que os anteriores, revelando uma notável diminuição nos números de notificações de casos e tratamento da doença, aliados ao aumento do número de indivíduos mortos pela doença, relacionados principalmente com o advento e esforços para conter a COVID-19. Apesar de ter tratamento efetivo, a tuberculose continua sendo uma grande preocupação, uma vez que há diversas cepas resistentes aos fármacos utilizados para o tratamento e indivíduos com a forma latente atuam como reservatórios da doença. Os mecanismos de resistência são amplamente estudados como estratégia de desenvolvimento de novos fármacos. O composto triclosan tem seu mecanismo de resistência elucidado e a relação com diferentes subtipos de proteínas enoil-redutases relatado. Com o propósito de aumentar o entendimento acerca da biologia do patógeno, buscamos prospectar possíveis enoil-redutases alternativas à InhA em Mycobacterium tuberculosis. No capítulo 1 dessa tese é apresentada, na forma de um manuscrito publicado na revista Frontiers in Microbiology, uma revisão de literatura acerca dos diversos subtipos de enoil-redutases encontradas, dos organismos que as possuem e de sua atuação na síntese de ácidos graxos. No capítulo seguinte, estruturado na forma de um segundo manuscrito, são relatadas análises referentes às proteínas codificadas por três genes de M. tuberculosis (Rv3553, Rv0021c e Rv1533), que se mostraram altamente similares estruturalmente à proteína FabK de Streptococcus pneumoniae (SpFabK), pertencente a uma família de enoil-redutases alternativa à família a qual pertence à proteína InhA de M. tuberculosis. Para cada um dos genes, são descritas as modificações estruturais presentes nas regiões correspondentes ao sítio ativo da SpFabK. Além disso, são apresentados, para cada um dos três genes, dados de vulnerabilidade utilizando a técnica de silenciamento gênico CRISPR de interferência, a habilidade de infecção de células de macrófagos murinos, e a concentração inibitória mínima de cepas merodiploides para triclosan e isoniazida. Apenas o silenciamento do gene Rv1533 perturbou o crescimento do bacilo nas condições testadas. Ainda no capítulo 2, são apresentadas as redes de coexpressão para os genes Rv3553 e Rv1484 e, com base em dados de RNA-Seq disponíveis publicamente, a análise de expressão diferencial dos três genes em condições de cultivo diferentes daquelas estudadas experimentalmente. Os resultados obtidos revelam que os genes Rv3553, Rv0021c e Rv1533 apresentam padrões de expressão distintos aos encontrados para o gene inhA. Ao final do capítulo 2, com base nos padrões de expressão diferencial observados, são tecidas considerações acerca do potencial do gene Rv1533 atuar como uma enoil-redutase alternativa em condições de depleção nutricional. Por fim, no capítulo 3, são acrescentados os resultados parciais encontrados: dados de essencialidade gênica para o gene Rv1533, análise de concentração inibitória mínima frente ao triclosan e à isoniazida e as quantificações de RNA mensageiro nas cepas com os genes silenciados. Finalmente, são descritas as considerações finais e perspectivas para o presente estudo.Submitted by PPG Biologia Celular e Molecular (bcm@pucrs.br) on 2022-07-01T18:04:40Z No. of bitstreams: 1 FERNANDA_SOUZA_MACCHI_HOPF_TES.pdf: 16825012 bytes, checksum: 25291b9836c528b6b00ab99f8fcad31b (MD5)Approved for entry into archive by Sheila Dias (sheila.dias@pucrs.br) on 2022-07-04T14:01:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 FERNANDA_SOUZA_MACCHI_HOPF_TES.pdf: 16825012 bytes, checksum: 25291b9836c528b6b00ab99f8fcad31b (MD5)Made available in DSpace on 2022-07-04T14:22:47Z (GMT). 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