Hibridoma OTA.1 : anticorpo anti-OTA no desenvolvimento da coluna de imunoafinidade e aplicação associada à qualidade e segurança de vinho - Ishikawa, Angélica Tieme (2024)
Resumo: O consumo moderado de vinho é recomendado baseado em efeito benéfico à saúde especialmente contra radicais livres, destaque ao resveratrol O monitoramento na cadeia produtiva de vinho deve ser executado por método rápido, sensível e específico, evitando contaminação por ocratoxina A (OTA) Considerando o emprego de bioferramentas, com destaque a coluna de imunoafinidade (CIA) na extração/concentração do analito de interesse e o ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay), como base para avanço tecnológico, a exemplo de biossensor, procedeu-se o cultivo de Hibridoma OTA1 produtor de anticorpo monoclonal (AcM) anti-OTA O cultivo de Hibridoma OTA1 foi iniciado em meio RPMI 164 suplementado com Soro Fetal Bovino (SFB) e L-glutamina, a 37 °C sob 5% CO2, e gradualmente substituído por meio Hibridoma-Serum Free Medium (H-SFM) nas proporções 15, 3, 5, 75, 8 e 1% O enriquecimento com 7 mmol L-1 de L-glutamina e cuidado especial em etapa inicial de cultivo, propiciou adaptação e expansão celular O AcM obtido foi precipitado com sulfato de amônio a 6 % de saturação, dialisado e empregado na confecção de 6 CIAs experimentais, imobilizando 5 mg de AcM 1 % H-SFM (CIA 1 e 2); 75:1 % H-SFM (1:1) (CIA 3, 4 e 5) e 75% H-SFM (CIA 6) em um mL de suporte Affi-gel 1, com modificações na metodologia padrão A Taxa de imobilização variou de 77,43±6,39 a 97,55±,24 %, sendo a CIA 6 desenvolvida com AcM 75 % de H-SFM dialisado em PBS ,15 mol L-1, com acoplamento a 4 ºC/24 h, apresentou alta atividade anti-OTA por i-ELISA, sugerindo que proteínas inerentes ao próprio cultivo favoreceram a imobilização de AcM Em paralelo, vinho argentino elaborado a partir de Vitis vinifera (n=26), bem como o vinho paranaense, de Vitis Labrusca- Bordô (n=34), foram avaliados perante contaminação de OTA por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE, Limite de detecção- LD =,5 ng mL-1 e Limite de quantificaçao - LQ= ,7 ng mL-1) e ELISA competitivo indireto (ic-ELISA, LD= ,17 ng mL-1 e LQ= ,32 ng mL-1); além de característica de qualidade avaliada por capacidade antioxidante (CAO), trans-resveratrol e parâmetros cromáticos (L*-luminosidade, C*-croma e hgraus -tonalidade cromática) foram analisados em 6 amostras Apenas uma amostra (,12 ±,1 ng mL-1) apresentou contaminação de OTA por CLAE, e 11 por ic-ELISA, com nível de contaminação abaixo do limite estabelecido pela legislação brasileira e Comunidade Européia (2 ng mL-1) A detecção falso-positivo de OTA por ic-ELISA foi explicado pela relação de trans-resveratrol e OTA (Análise de Componentes Principais -ACP), mostrando interferência de matriz O vinho elaborado com Bordô apresentou média de CAO 4,57 mmol L-1, enquanto o vinho elaborado com V vinifera, 8,35 mmol L-1 O trans-resveratrol foi detectado em 57 amostras de 6, sendo o nível em vinho Argentino (1,35 mg L-1) mais baixo em relação ao vinho Bordô (3,33 mg L-1) (p<,5) O vinho de Paraná apresentou maior luminosidade em relação ao argentino, ie, cor mais clara, entretanto valores de croma e tonalidade cromática não diferiram estatisticamente (p>,5) Os vinhos sul-americanos mostraram perfil interessante apresentando níveis alto de antioxidante e baixa contaminação por OTA Por outro lado, nível elevado de trans-resveratrol atuou como interferente em ic-ELISA resultando em falso-positivo, o conhecimento dessa influência permitirá aperfeiçoar o emprego dessa bioferramenta sensível aplicado ao vinho