Clonagem de cDNAS codificando globulinas 7S (Vicilinas) de dois genótipos de CAUPI [Vigna unguiculata (L.) Walp] com resposta contrastante ao caruncho (Callosobruchus maculatus): simulações computacionais revelam como as vicilinas do CAUPI interagem com Quitina.

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2018
Autor(a) principal: Rocha, Antônio José
Orientador(a): Grangeiro, Thalles Barbosa
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Tese
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Não Informado pela instituição
Programa de Pós-Graduação: Não Informado pela instituição
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Não Informado pela instituição
Palavras-chave em Português:
Proteínas de armazenamento de sementes
Leguminosae
Callosobruchus maculatus
local de ligação de quitina
defesa vegetal
Link de acesso: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/31929
Resumo: ROCHA, Antônio José. Clonagem de cDNAS codificando globulinas 7S (Vicilinas) de dois genótipos de CAUPI [Vigna unguiculata (L.) Walp] com resposta contrastante ao caruncho (Callosobruchus maculatus): simulações computacionais revelam como as vicilinas do CAUPI interagem com Quitina. 2018. 117 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2018.
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Several studies correlate the resistance of some cowpea cultivars to one or more variants of vicillins, 7S globulins that are one of the main reserve proteins of these seeds. These variants bind strongly to the chitin of the peritrophic membrane of C. maculatus larvae, impairing the absorption of nutrients and, consequently, causing their mortality. On the other hand, varicose veins of cultivars susceptible to C. maculatus bind poorly to chitin. But so far, the structural differences that are at the origin of the differentiated interaction between the variants of vicillin and chitin are still unknown. For this reason, the main objective of the present study was to investigate the structural basis of this differentiated behavior of variants of 7S vicillins that could explain, at least in part, the resistance of seeds of some cowpea cultivars to C. maculatus. In this work, partial cDNA sequences coding for cowpea vicillin were obtained from developing seeds of the EPACE-10 genotypes (susceptible to C. maculatus) and IT81D-1053 (brucellosis resistant) genotypes by PCR amplification, cloning and sequencing. The deduced amino acid sequences of the cDNA sequences were then compared to verify possible differences that could exist between the variants of 7S vicilins. Three-dimensional molecular models of cowpea vicillin, obtained by homology modeling, showed the typical characteristics of the domain of the members of the superfamily of the termites. Computational simulations using docking techniques and molecular dynamics revealed that each trimer of vicillin contained three chitin binding sites, each located at the apex of the triangle-shaped oligomer, which is characteristic of 7S globulins. The interaction models predicted that the carbohydrate molecules, embedded in the identified sites, were stabilized mainly by hydrogen bonds, many of them mediated by water molecules, a common structural feature observed in a large variety of proteins that bind to carbohydrates. In addition, many of the residues involved in the chitin binding sites of cowpea vicillin are conserved in other 7S globulins. Using a quantum mechanical-based method, the free energies of binding of chito-oligosaccharide molecules to the β-vignin oligomers were calculated, ranging from -690.6 kcal / mol (GlcNAc oligomers bound to β-vignin trimer R2) to -531.3 kcal / mol (chitin fragments bound to the β-vignin oligomer R3). These results agree with previous studies that demonstrated that cowpea vicillins purified from seeds of C. maculatus susceptible or resistant genotypes have the ability to bind in vitro to chitin and in vivo to chitin structures of the midgut of larvae. In addition, the conservation in other 7S globulins of many of the residues constituting the β-vignin chitin binding site as predicted in this paper also supports previous hypotheses that have shown that the vicillins of other legume species can also bind to chitin. The results of the present work provide the first description of the molecular mechanism involved in the interaction between cowpea and chitin vicillins.O feijão caupi (Vigna unguiculata) é uma leguminosa que tem grande importância socioeconômica no Nordeste brasileiro. Entretanto, na fase de pós-colheita, um dos problemas enfrentados pelos agricultores é a infestação pelo Calosobruchus maculatus (Coleoptera: Bruchidae). Essa praga pode causar danos significativos às sementes, diminuindo seu teor nutricional e valor econômico. Diversos trabalhos correlacionam a resistência de alguns cultivares de caupi a uma ou mais variantes de vicilinas, globulinas 7S que são uma das principais proteínas de reserva dessas sementes. Essas variantes se ligam fortemente à quitina da membrana peritrófica de larvas de C. maculatus, prejudicando a absorção de nutrientes e, por consequência, causando mortalidade das mesmas. Por outro lado, variantes de vicilinas de cultivares susceptíveis ao C. maculatus se ligam fracamente à quitina. Mas até o momento, as diferenças estruturais que estão na origem da interação diferenciada entre as variantes de vicilinas e a quitina ainda são desconhecidas. Por essa razão, o objetivo principal do presente estudo foi investigar a base estrutural desse comportamento diferenciado das variantes de vicilinas 7S que poderiam explicar, pelo menos em parte, a resistência de sementes de algumas cultivares de caupi ao C. maculatus. Neste trabalho, as sequências parciais de cDNA que codificam vicilinas de caupi foram obtidas a partir de sementes em desenvolvimento dos genótipos EPACE-10 (suscetível ao C. maculatus) e IT81D-1053 (resistente ao bruquídeo), mediante amplificação por PCR, clonagem e sequenciamento. As sequências de aminoácidos deduzidas das sequências dos cDNAs foram então comparadas para se verificar as possíveis diferenças que poderiam existir entre as variantes de vicilinas 7S. Modelos moleculares tridimensionais das vicilinas de caupi, obtidos por modelagem por homologia, mostraram as características típicas do domínio dos membros da superfamília das cupinas. Simulações computacionais usando técnicas de docking e dinâmica molecular revelaram que cada trímero de vicilina continha três sítios de ligação à quitina, cada um localizado no vértice do oligômero em forma de triângulo, que é característico das globulinas 7S. Os modelos de interação previram que as moléculas de carboidrato, encaixadas nos sítios identificados, foram estabilizadas principalmente por pontes de hidrogênio, muitas delas mediadas por moléculas de água, uma característica estrutural comum observada em uma grande variedade de proteínas que se ligam a carboidratos. Além disso, muitos dos resíduos envolvidos nos locais de ligação à quitina de vicilinas de caupi são conservados em outras globulinas 7S. Utilizando um método baseado em mecânica quântica, as energias livres de ligação de moléculas de quito-oligossacarídeos aos oligómeros de β-vignina foram calculadas, variando de -690,6 kcal / mol (oligômeros de GlcNAc ligados ao trímero de β-vignina R2) a -531,3 kcal / mol (fragmentos de quitina ligados ao oligômero β-vignina R3). Estes resultados concordam com trabalhos anteriores, que demonstraram que as vicilinas de caupi purificadas a partir de sementes de genótipos suscetíveis ou resistentes a C. maculatus têm a capacidade de se ligar in vitro à quitina e in vivo a estruturas quitinosas do intestino médio das larvas. Além disso, a conservação em outras globulinas 7S de muitos dos resíduos que constituem o sítio de ligação a quitina de β-vignina, como previsto neste trabalho, também suporta as hipóteses anteriores que mostraram que as vicilinas de outras espécies de leguminosas também podem se ligar à quitina. Os resultados do presente trabalho fornecem a primeira descrição do mecanismo molecular envolvido na interação entre vicilinas de caupi e quitina.Proteínas de armazenamento de sementesLeguminosaeCallosobruchus maculatuslocal de ligação de quitinadefesa vegetalClonagem de cDNAS codificando globulinas 7S (Vicilinas) de dois genótipos de CAUPI [Vigna unguiculata (L.) Walp] com resposta contrastante ao caruncho (Callosobruchus maculatus): simulações computacionais revelam como as vicilinas do CAUPI interagem com Quitina.Cloning of cDNA sequences encoding cowpea (Vigna unguiculata) vicilins: molecular modeling, docking calculations and molecular dynamics simulations suggest a binding mode of cowpea vicilins to chitin oligomersinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisporreponame:Repositório Institucional da Universidade Federal do Ceará (UFC)instname:Universidade Federal do Ceará (UFC)instacron:UFCinfo:eu-repo/semantics/openAccessLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-81748http://repositorio.ufc.br/bitstream/riufc/31929/2/license.txt8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33MD52ORIGINAL2018_tese_ajrocha.pdf2018_tese_ajrocha.pdfapplication/pdf3422060http://repositorio.ufc.br/bitstream/riufc/31929/3/2018_tese_ajrocha.pdf25d96efcd87cac806a15433b919f9d48MD53riufc/319292018-05-15 19:46:03.42oai:repositorio.ufc.br:riufc/31929Tk9URTogUExBQ0UgWU9VUiBPV04gTElDRU5TRSBIRVJFClRoaXMgc2FtcGxlIGxpY2Vuc2UgaXMgcHJvdmlkZWQgZm9yIGluZm9ybWF0aW9uYWwgcHVycG9zZXMgb25seS4KCk5PTi1FWENMVVNJVkUgRElTVFJJQlVUSU9OIExJQ0VOU0UKCkJ5IHNpZ25pbmcgYW5kIHN1Ym1pdHRpbmcgdGhpcyBsaWNlbnNlLCB5b3UgKHRoZSBhdXRob3Iocykgb3IgY29weXJpZ2h0Cm93bmVyKSBncmFudHMgdG8gRFNwYWNlIFVuaXZlcnNpdHkgKERTVSkgdGhlIG5vbi1leGNsdXNpdmUgcmlnaHQgdG8gcmVwcm9kdWNlLAp0cmFuc2xhdGUgKGFzIGRlZmluZWQgYmVsb3cpLCBhbmQvb3IgZGlzdHJpYnV0ZSB5b3VyIHN1Ym1pc3Npb24gKGluY2x1ZGluZwp0aGUgYWJzdHJhY3QpIHdvcmxkd2lkZSBpbiBwcmludCBhbmQgZWxlY3Ryb25pYyBmb3JtYXQgYW5kIGluIGFueSBtZWRpdW0sCmluY2x1ZGluZyBidXQgbm90IGxpbWl0ZWQgdG8gYXVkaW8gb3IgdmlkZW8uCgpZb3UgYWdyZWUgdGhhdCBEU1UgbWF5LCB3aXRob3V0IGNoYW5naW5nIHRoZSBjb250ZW50LCB0cmFuc2xhdGUgdGhlCnN1Ym1pc3Npb24gdG8gYW55IG1lZGl1bSBvciBmb3JtYXQgZm9yIHRoZSBwdXJwb3NlIG9mIHByZXNlcnZhdGlvbi4KCllvdSBhbHNvIGFncmVlIHRoYXQgRFNVIG1heSBrZWVwIG1vcmUgdGhhbiBvbmUgY29weSBvZiB0aGlzIHN1Ym1pc3Npb24gZm9yCnB1cnBvc2VzIG9mIHNlY3VyaXR5LCBiYWNrLXVwIGFuZCBwcmVzZXJ2YXRpb24uCgpZb3UgcmVwcmVzZW50IHRoYXQgdGhlIHN1Ym1pc3Npb24gaXMgeW91ciBvcmlnaW5hbCB3b3JrLCBhbmQgdGhhdCB5b3UgaGF2ZQp0aGUgcmlnaHQgdG8gZ3JhbnQgdGhlIHJpZ2h0cyBjb250YWluZWQgaW4gdGhpcyBsaWNlbnNlLiBZb3UgYWxzbyByZXByZXNlbnQKdGhhdCB5b3VyIHN1Ym1pc3Npb24gZG9lcyBub3QsIHRvIHRoZSBiZXN0IG9mIHlvdXIga25vd2xlZGdlLCBpbmZyaW5nZSB1cG9uCmFueW9uZSdzIGNvcHlyaWdodC4KCklmIHRoZSBzdWJtaXNzaW9uIGNvbnRhaW5zIG1hdGVyaWFsIGZvciB3aGljaCB5b3UgZG8gbm90IGhvbGQgY29weXJpZ2h0LAp5b3UgcmVwcmVzZW50IHRoYXQgeW91IGhhdmUgb2J0YWluZWQgdGhlIHVucmVzdHJpY3RlZCBwZXJtaXNzaW9uIG9mIHRoZQpjb3B5cmlnaHQgb3duZXIgdG8gZ3JhbnQgRFNVIHRoZSByaWdodHMgcmVxdWlyZWQgYnkgdGhpcyBsaWNlbnNlLCBhbmQgdGhhdApzdWNoIHRoaXJkLXBhcnR5IG93bmVkIG1hdGVyaWFsIGlzIGNsZWFybHkgaWRlbnRpZmllZCBhbmQgYWNrbm93bGVkZ2VkCndpdGhpbiB0aGUgdGV4dCBvciBjb250ZW50IG9mIHRoZSBzdWJtaXNzaW9uLgoKSUYgVEhFIFNVQk1JU1NJT04gSVMgQkFTRUQgVVBPTiBXT1JLIFRIQVQgSEFTIEJFRU4gU1BPTlNPUkVEIE9SIFNVUFBPUlRFRApCWSBBTiBBR0VOQ1kgT1IgT1JHQU5JWkFUSU9OIE9USEVSIFRIQU4gRFNVLCBZT1UgUkVQUkVTRU5UIFRIQVQgWU9VIEhBVkUKRlVMRklMTEVEIEFOWSBSSUdIVCBPRiBSRVZJRVcgT1IgT1RIRVIgT0JMSUdBVElPTlMgUkVRVUlSRUQgQlkgU1VDSApDT05UUkFDVCBPUiBBR1JFRU1FTlQuCgpEU1Ugd2lsbCBjbGVhcmx5IGlkZW50aWZ5IHlvdXIgbmFtZShzKSBhcyB0aGUgYXV0aG9yKHMpIG9yIG93bmVyKHMpIG9mIHRoZQpzdWJtaXNzaW9uLCBhbmQgd2lsbCBub3QgbWFrZSBhbnkgYWx0ZXJhdGlvbiwgb3RoZXIgdGhhbiBhcyBhbGxvd2VkIGJ5IHRoaXMKbGljZW5zZSwgdG8geW91ciBzdWJtaXNzaW9uLgo=Repositório InstitucionalPUBhttp://www.repositorio.ufc.br/ri-oai/requestbu@ufc.br || repositorio@ufc.bropendoar:2018-05-15T22:46:03Repositório Institucional da Universidade Federal do Ceará (UFC) - Universidade Federal do Ceará (UFC)false
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