Análise da liofilização como novo método de isolamento de vesículas extracelulares da saliva. - Santos, Thalita Alves Barreto (2024)
As vesículas extracelulares (VEs) parecem ser um potencial biomarcador porque são mensuráveis antes ou durante a manifestação clínica de inúmeras doenças e alvos terapêuticos. Nosso objetivo foi examinar quão eficaz é o processo de liofilização para a maior recuperação de microRNAs de amostras de saliva. Amostras de saliva foram coletadas por meio de enxágue bucal com solução 0,9% soro fisiológico. Cinco protocolos para preparo de amostras foram realizados antes ou depois da liofilização. O RNA total foi isolado por Trizol, seguido de segunda purificação (Optimization Protocolo). As VEs foram analisados por microscopia eletrônica para localização CD63/CD9, análise de membrana, dot blotting e dispersão de luz quase elástica (QELS). A reação de transcrição foi realizada utilizando o kit de transcrição reversa TaqMan® MicroRNA. PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) foi realizado para analisar miRNAs liofilizado e ultracentrifugado (Controle). A comparação entre a concentração de RNA total (ng/ml) em diferentes amostras, para protocolos de preparação do sobrenadante de saliva liofilizada, mostraram diferenças entre os grupos, p<0,0001. Porém, as amostras liofilizadas apresentaram relações 260/280 acima de 1,80(±0,15), mostrando alta pureza da amostra. A análise qRT-PCR demonstrou a presença de miR-16, miR-21, miR-33a e miR-146b nas amostras liofilizadas e ultracentrifugadas. A análise de microscopia eletrônica de VEs mostrou semelhanças em tamanho, distribuição de partículas e localização CD63/CD9 na membrana para liofilização e ultracentrifugação. Análise QELS dasVEs apresentaram tamanhos distintos (30 a 70 nm) e (300 a 370 nm) para ambos os métodos. Além disso, a análise do qRT-PCR demonstrou a amplificação de alguns microRNAs (mir-16, mir-21, mir-33a e mir-146b) no sobrenadante de saliva liofilizada e ultracentrifugada, caracterizando assim liofilização como um novo método de isolamento de vesículas extracelulares de biofluidos.