Desenvolvimento e validação de método para o monitoramento de rizóbios elite inoculados no feijoeiro utilizando PCR e qPCR - Silva, Cleudison Gabriel Nascimento da (2022)
O feijoeiro é uma planta capaz de realizar simbiose com rizóbios de modo que a Fixação Biológica de Nitrogênio é uma alternativa sustentável na utilização de adubos nitrogenados para a cultura. No entanto, o sucesso da simbiose depende de diversos fatores bióticos e abióticos, dentre eles, a competitividade de estirpes selecionadas frente à microbiota natural existente no solo. Uma forma de acessar essa competitividade é pela avaliação da ocupação nodular e persistência da bactéria no solo. Porém, os métodos atualmente existentes são muito laboriosos e/ou não apresentam especificidade suficiente para diferenciar as estirpes inoculadas de rizóbios nativos do solo. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e suas variantes se apresentam como uma alternativa conveniente e de alta especificidade para o monitoramento e a quantificação de microrganismos associados a plantas e/ou no solo. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho foi desenhar e validar primers estirpe-específicos para detectar e quantificar as bactérias Rhizobium tropici estirpe CIAT 899 e CPAC H12 e R. freirei estirpe PRF 81, utilizando as técnicas de PCR e PCR em Tempo Real (qPCR). Para tal, os primers foram desenhados a partir de regiões codantes do genoma e selecionados in silico de modo a conter sequências de DNA exclusivas do genoma de cada estirpe. O processo de validação desses primers envolveu teste de especificidade exclusiva para as estirpes alvo em relação a outras geneticamente próximas e distante a elas, ensaios de PCR envolvendo diversos extratos de DNA e avaliação da ocupação nodular em experimentos de casa de vegetação. Cada par de primer foi avaliado principalmente quanto a sua eficiência de amplificação e curva de dissociação e, posteriormente, quanto a quantificação das estirpes alvo a partir das amostras de DNA isoladas de raízes e solo rizosférico do feijoeiro. Por fim, os pares de primers foram testados quanto a sua aplicabilidade para avaliar a taxa de ocupação nodular e quantificar a população de rizóbios elite em solo rizosférico e raízes do feijoeiro em condição de campo. Essas informações permitiram discorrer sobre os dados de nodulação e fitotécnicos inerentes à interação rizóbio-planta, bem como a aptidão das estirpes CIAT 899, CPAC H12 e PRF 81 para nodular o feijoeiro.