Otimização de parâmetros de transformação genética e criopreservação de Eucalyptus grandis X Eucalyptus urophylla - Vaz, Chaiane Fernandes (2016)
O objetivo do trabalho foi estabelecer parâmetros de transformação genética para o híbrido Eucalyptus grandis X Eucalyptus urophylla, mediado por Agrobacterium tumefaciens, bem como realizar a criopreservação de ápices caulinares para o mesmo híbrido, visando seu armazenamento e sua conservação. Os calos organogênicos deste híbrido foram submetidos a diferentes processos de transformação, infiltração a vácuo (4 e 8 minutos com pressão de 400 mmHg), sonicação (15 e 30 segundos a uma frequência de 40 kHz), os tratamentos foram aplicados de forma combinada e isolada. Paralelamente, foram avaliados três concentrações de acetoseringona (100 µM, 200 µM e 300 µM) e três temperaturas de co-cultivo (19 ºC, 22 ºC e 25 ºC). Dentre os parâmetros estudados, a maior média da expressão transiente foi obtida quando se utilizou o método de infecção por infiltração a vácuo durante 4 minutos com média de expressão transiente da atividade do GUS (4,4), a adição de 100 μM de acetoseringona com média de expressão transiente (0,76), e o co-cultivo sob temperatura de 19 ºC com maior média de expressão transiente (2,6). Para o processo de criopreservação foi determinado o meio de cultura para a regeneração dos ápices, testando diferentes concentrações de BAP (0,14 µM; 1,42 µM) e BAP (0,14 µM) em combinação com AIA (5,10 µM), após 30 dias avaliou-se percentagem de regeneração de plantas, formação de calos e plantas hiper-hídricas. Para a criopreservação realizou-se o pré-cultivo dos ápices em meio MS suplementado com sacarose a 0,2 M por 24 horas e sacarose 0,5 M por mais 24 horas e foram avaliados seis tempos de exposição ao PVS2 (20, 40, 60, 80, 100 e 120 minutos) e posterior imersão em nitrogênio líquido. Após 30 dias avaliou-se percentagem de sobrevivência e após 60 dias percentagem de regeneração dos ápices. As observações histológicas e ultra-estruturais dos ápices foram realizadas em diferentes fases do processo de criopreservação e após uma semana de recuperação. As variáveis analisadas foram plasmólise, danos celulares, núcleos pinóticos e ruptura de membrana. Para avaliação da percentagem de plasmólise foram realizadas medições da área da parede celular e do citoplasma em três camadas dos ápices caulinares (L1; L1 -L3; L7-L9), utilizando o software imagePro Plus®. A concentração de 0,14 µM de BAP promoveu melhores taxas de regeneração (80%) sem presença de plantas hiper-hídricas. A criopreservação foi bem sucedida quando os ápices foram expostos ao crioprotetor por 60 minutos de PVS2, com maiores taxas de regeneração (66%), proporcionando uma maior integridade celular, sem a presença de núcleos pinóticos, com baixas taxas de plasmólise.