Identificação, classificação e anotação de enzimas desubiquitinadoras e ubiquitina-símile em Trypanosoma cruzi.

• Ano de defesa: 2009
• Autor(a) principal: Olmo, Roenick Proveti
• Orientador(a): Cota, Renata Guerra de Sá
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
• Palavras-chave em Português: Trypanosoma cruzi; Ubiquitina; Enzimas; Doença de Chagas; Genoma - leishmania major
• Link de acesso: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/2716

O sequenciamento do genoma de Leishmania major, Trypanosoma cruzi e T. brucei mostrou que cada genoma contém entre 8300-1200 genes que codificam proteínas, dos quais aproximadamente 6500 são comuns entre estas espécies. Neste estudo nós focamos a busca nos bancos de dados de tripanossomatídeos por proteínas envolvidas com o metabolismo de ubiquitina. Existem basicamente nove subfamílias distintas de enzimas envolvidas com esta via, denominadas DUBs: ubiquitina C-terminal hidrolases (UCHs), proteases específicas ao processamento de ubiquitina (USPs), proteases relacionadas à doença de Machado-Joseph (MJDs), proteases de tumor ovariano, também chamadas otubaínas (OTUs), proteases com motivo JAMM, sentrinas, autofaginas, peptidases semelhantes à papaína de vírus de RNA de fita dupla e eucariotas (PPPDEs), e metaloproteases Wss1p-símile (WLMs). Neste trabalho nós utilizamos ferramentas de bioinformática para identificar esse repertório de enzimas nos bancos de dados públicos de genomas das espécies L. infantum, L. major, L. braziliensis, T. brucei e T. cruzi. Nossa pesquisa in silico obteve 163 possíveis entradas que codificam para DUBs nestas espécies quando comparadas por BLASTx à proteínas ortólogas conhecidas no GenBank. Destas, 84 pertenciam à subfamília USP, 10 à JAMM, 10 à UCH, 15 à OTU, 5 à sentrina, 24 à PPPDE, 10 à autofagina, 5 à WLM, e não foram encontradas sequências correspondentes à MJD. No genoma do T. cruzi foi também observado a presença de genes duplicados, onde 63 entradas puderam ser resumidas, com no mínimo 95% de similaridade, à 34 entradas. No entanto, em cada genoma de Leishmania estudado foram encontrados em média 32 entradas para DUBs, e sua maioria possuindo ortólogos no mesmo gênero. Análises comparativas dos genes responsáveis pela remoção de ubiquitina mostraram diferenças significativas nos tamanhos das suas sequências de nucleotídeos bem como em suas composições de aminoácidos, especialmente nas regiões não cobertas por domínios conservados, sugerindo que há manutenção da função, mas diferente especificidade aos substratos. Além disso, a expressão relativa dos genes TcUSP7, -10, -14, -15 e TcUCH-L3 determinadas por RT-qPCR mostraram perfis similares de expressão em formas epimastigotas das cepas Berenice-62, Berenice-78, Colombiana e Y do T. cruzi. No entanto, os níveis de TcUSP15 foram menores quando comparados às outras cepas analisadas neste estudo, enquanto os níveis de TcUCH-L3 foram os maiores. Finalmente, nós determinamos a atividade DUB utilizando o substrato CBZ-Gly-Gly- Arg-7-amido-4-metilcumarina em extratos nucleares e citosólicos e a conjugação de proteínas com ubiquitina e SUMO nos mesmos extratos utilizando western blot e anticorpos específicos para ubiquitina e SUMO. Nossos resultados mostraram que a atividade é predominantemente citosólica. A técnica de western blotting mostrou que os conjugados ubiquitinados são preferencialmente encontrados no citoplasma e os sumorilados no núcleo. Esses resultados evidenciam a complexidade e diversidade das DUBs em tripanossomatídeos e abre a possibilidade de explorar a relevância das interações na regulação das vias mediadas por ubiquitina nesses parasitos.