Purificação preparativa de inibidores Bowman-Birk, quantificação em alimentos e características imunogênicas dos inibidores da Glycine max e da Macrotyloma axillare. - Leal, Sonaly Cristine (2010)
Os inibidores do tipo Bowman-Birk, comumente chamados de BBI, são moléculas protéicas caracterizadas pela presença de dois domínios independentes, capazes de inibir serino-proteases. Embora os mecanismos de atividade biológica dessas moléculas não estejam totalmente elucidados, o interesse por essa classe de inibidores está relacionado com a descoberta de que o BBI pode atuar como agente preventivo do câncer. A capacidade do BBI de prevenir a carcinogênese tem sido estudada extensivamente, tanto em sua forma purificada quanto na forma de extrato protéico de soja enriquecido de BBI, chamado de BBI concentrado (BBIC). O emprego desses extratos enriquecidos em experimentos com animais e humanos deve-se ao elevado custo para a obtenção do BBI puro. Vários estudos demonstraram que esses extratos possuem atividade anti-carcinogênica similar ao BBI purificado. Entretanto, essa atividade, atribuída apenas ao BBI, poderia estar relacionada à presença de outros compostos quimiopreventivos nas preparações de BBIC, tais como a lunasina, isoflavonas e outros inibidores de tripsina. Desta forma, o primeiro objetivo deste trabalho baseou-se no desenvolvimento de métodos alternativos capazes de fornecer um enriquecido de BBI de soja de melhor qualidade, utilizando apenas processos típicos da indústria alimentícia. Os métodos propostos geraram preparações com elevado grau de pureza, comparado à homogeneidade das preparações de BBIC descritas anteriormente. A principal alteração do método tradicional de obtenção do BBIC consistiu na adição de EDTA ou citrato durante o tratamento térmico dos extratos protéicos. A análise das preparações por SDS-PAGE demonstrou que o BBI recuperado apresentou elevado grau de pureza. O uso de agentes quelantes provavelmente promoveu uma desestabilização das proteínas contaminantes, permitindo a remoção das mesmas por precipitação. Os inibidores Bowman-Birk, resultantes do emprego das metodologias propostas, foram identificados e caracterizados através de ensaios de atividade inibitória anti-tripsina e anti-quimotripsina, cromatografia de fase reversa e espectrometria de massa. Em paralelo, demonstramos que os anticorpos anti-BBI de Macrotyloma axillare foram úteis na identificação de BBIS por Western blot em nossas preparações. Essa reatividade cruzada pode ser atribuída à alta homologia estrutural compartilhada por esses inibidores encontrados nessas leguminosas. Por outro lado, experimentos realizados com anticorpos produzidos contra BBI de soja Glycine max (BBIS) e peptídeo sintético, correspondente à cabeça de inibição da quimotripsina do BBI, sugeriram que ambos inibidores são menos imunogênicos que o BBI de Macrotyloma axillare (BBIM). O terceiro objetivo consistiu na validação de um método de quantificação de BBI ativo presente em alimentos, através de ensaios de inibição enzimática. A metodologia desenvolvida foi de simples execução e demonstrou elevada sensibilidade, sendo comparável às técnicas imunoenzimáticas, tipicamente utilizadas para determinar a concentração de BBI em alimentos. A próxima estratégia envolveu a suplementação de dieta com 0,1% p/p de BBI e a avaliação do consumo de ração, durante um mês de tratamento. Os resultados mostraram que não houve diferença significativa no consumo da dieta e no peso dos animais entre os grupos controle e testes, sugerindo que a suplementação de alimentos com BBI pode constituir uma alternativa para estimular o consumo humano desse inibidor. Experimentos futuros poderão elucidar se as preparações de BBI utilizadas como suplementos em alimentos comprometem a palatabilidade dos mesmos. Entretanto, deve ser levada em consideração a observação de que camundongos alimentados oralmente com esse inibidor, produzem anticorpos anti-BBI os quais poderiam limitar a atividade do BBI como agente anti-carcinogênico.