Engenharia, caracterização estrutural e avaliação imunológica de antígenos de DENV, ZIKV e HIV-1

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2018
Autor(a) principal: COÊLHO, Danilo Fernandes
Orientador(a): LINS, Roberto Dias
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Tese
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Universidade Federal de Pernambuco
Programa de Pós-Graduação: Programa de Pos Graduacao em Quimica
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Brasil
Palavras-chave em Português:
Link de acesso: https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/32086
Resumo: Utilizando métodos de engenharia de proteínas e simulação por dinâmica molecular (MD), o propósito deste trabalho foi o desenvolvimento in silico e caracterização de proteínas/peptídeos para uso como antígenos de diagnóstico ou como biomarcador. Os vírus alvos neste estudo foram os vírus da dengue (DENV), zika (ZIKV) e HIV-1. Através da estratégia de threading seguida do de novo design e análise por MD, elementos estruturais da proteína NS1 de DENV foram transplantados para a Top7. Foram desenvolvidas 3 quimeras: 2S20-30_Top7, 7S22-24_Top7 e 8S22-25_Top7. As três proteínas foram avaliadas imunologicamente por ensaios de ELISA e os resultados sugerem que dois antígenos são reconhecidos por anticorpos humanos anti-DENV1 e 2 e reagem moderadamente com anti-DENV-3 e 4, reproduzindo dados da literatura. A metodologia aplicada permite uma triagem evitando o uso dispendioso de alocação computacional e insumos de laboratório. Na segunda parte do trabalho, foi avaliada a estabilidade estrutural da proteína Top7-2F5 após reação de biotinilação. Análises de dicroísmo circular e de MD indicam que o processo de biotinilação não compromete a estrutura nativa da Top7-2F5. Os dados também indicam diferentes propriedades eletrostáticas que induzem a uma menor capacidade de ser reconhecida pelo mAb 2F5 e induz maior solubilidade das proteínas biotiniladas. Na terceira parte, através do método MotifGraft, seguido de análise de MD, dois epítopos da proteína envelope (E) e um da NS4b de ZIKV foram carreados nas proteínas FNIII e TL1A. Também foi identificado um peptídeo baseado na proteína E de ZIKV, com baixo grau de similaridade com os demais flavivírus. A parte C-terminal do peptídeo conserva conformação nativa, possibilitando reconhecimento por anticorpos anti-EZIKV. O peptídeo foi utilizado para obtenção de anticorpos policlonais específicos para ZIKV para o desenvolvimento de um ensaio de ELISA sanduíche.
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As três proteínas foram avaliadas imunologicamente por ensaios de ELISA e os resultados sugerem que dois antígenos são reconhecidos por anticorpos humanos anti-DENV1 e 2 e reagem moderadamente com anti-DENV-3 e 4, reproduzindo dados da literatura. A metodologia aplicada permite uma triagem evitando o uso dispendioso de alocação computacional e insumos de laboratório. Na segunda parte do trabalho, foi avaliada a estabilidade estrutural da proteína Top7-2F5 após reação de biotinilação. Análises de dicroísmo circular e de MD indicam que o processo de biotinilação não compromete a estrutura nativa da Top7-2F5. Os dados também indicam diferentes propriedades eletrostáticas que induzem a uma menor capacidade de ser reconhecida pelo mAb 2F5 e induz maior solubilidade das proteínas biotiniladas. Na terceira parte, através do método MotifGraft, seguido de análise de MD, dois epítopos da proteína envelope (E) e um da NS4b de ZIKV foram carreados nas proteínas FNIII e TL1A. Também foi identificado um peptídeo baseado na proteína E de ZIKV, com baixo grau de similaridade com os demais flavivírus. A parte C-terminal do peptídeo conserva conformação nativa, possibilitando reconhecimento por anticorpos anti-EZIKV. O peptídeo foi utilizado para obtenção de anticorpos policlonais específicos para ZIKV para o desenvolvimento de um ensaio de ELISA sanduíche.CAPESUsing protein engineering and molecular dynamics (MD) methods, the purpose of this work was to develop proteins/peptide in silico and to experimentally characterize their use as potential diagnostic antigens or as a biomarker. The target viruses in this study were dengue virus (DENV), zika virus (ZIKV) and HIV-1. Through the threading strategy followed by de novo design and MD analysis, structural elements of the DENV NS1 protein were transplanted to Top7 scaffold. Three chimeras were developed: 2S20-30_Top7, 7S22-24_Top7 and 8S22-25_Top7. The three proteins were immunologically evaluated by ELISA assays and the results suggest that two antigens are recognized by anti-DENV1 and 2 human antibodies, but react moderately with anti-DENV-3 and 4, according to literature data. The applied methodology allows screening of new antigens, avoiding the expensive use of computational allocation and laboratory work. In the second part of the work, the structural stability of the Top7-2F5 protein was evaluated after biotinylation reaction. Results of circular dichroism and MD indicate that the biotinylation process does not compromise the native structure of Top7-2F5-Biotin. The data also indicate different electrostatic properties that induce a lower capacity to be recognized by mAb 2F5 and induce greater solubility of the biotinylated proteins. In the third part, protein engineering was used to develop peptides and proteins harboring ZIKV epitopes for diagnostic and / or vaccine purposes. Using MotifGraft method, followed by MD analysis, two epitopes of envelope protein (E) and one of ZIKV NS4b were loaded onto the FNIII and TL1A proteins. A peptide based on the ZIKV E protein was also identified, with a low degree of similarity to the other flaviviruses. The Cterminal part of the peptide conserves native conformation, allowing recognition by anti-E-ZIKV antibodies. The peptide was used to obtain polyclonal antibodies specific for ZIKV for the development of a sandwich ELISA assay.porUniversidade Federal de PernambucoPrograma de Pos Graduacao em QuimicaUFPEBrasilAttribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazilhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/info:eu-repo/semantics/openAccessQuímica teóricaZikaDengueHIV-1Engenharia, caracterização estrutural e avaliação imunológica de antígenos de DENV, ZIKV e HIV-1info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisdoutoradoreponame:Repositório Institucional da UFPEinstname:Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)instacron:UFPETHUMBNAILTESE Danilo Fernandes Coêlho.pdf.jpgTESE Danilo Fernandes Coêlho.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1211https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/32086/5/TESE%20Danilo%20Fernandes%20Co%c3%aalho.pdf.jpg100138fc609c9f00050cfdffe50aba3aMD55ORIGINALTESE Danilo Fernandes Coêlho.pdfTESE Danilo Fernandes Coêlho.pdfapplication/pdf10680735https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/32086/1/TESE%20Danilo%20Fernandes%20Co%c3%aalho.pdf48c3e04d79b5c011d88524f16611e5ebMD51CC-LICENSElicense_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; 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