Lipossomas de diferentes composições para entrega intracelular de Quantum Dots - MATOS, Anna Lívia Linard (2015)
Ensaios baseados em fluorescência possuem alta sensibilidade, o que pode proporcionar a identificação e quantificação de biomoléculas e ajudar a elucidar diversos eventos celulares. O desenvolvimento de novas sondas fluorescentes, tais como os Quantum Dots (QDs), tem permitido aos pesquisadores usufruir de todo o potencial de fluorescência. QDs são nanopartículas de materiais semicondutores, de 2 a 10 nm, que possuem características ópticas únicas, tais como fotoestabilidade. Todavia sua utilização no estudo intracelular ainda é limitada, pois sua passagem através da membrana celular não se dá passivamente, ficando preso em vesículas endocíticas, necessitando assim de um método que realize a sua entrega livre no citosol. Dentre algumas metodologias já descritas para entrega intracelular de QDs destacam-se a eletroporação, microinjeção e a fixação celular. Todavia, essas apresentam algumas desvantagens, sendo metodologias laboriosas ou danosas às células. Dentro dessa realidade os lipossomas fusogênicos aparecem como uma ferramenta capaz de sanar essas desvantagens, por serem vesículas de bicamadas lipídicas que podem se fundir às células liberando seu conteúdo no citosol. Assim, neste trabalho teve-se como objetivo desenvolver dois métodos utilizando lipossomas para carrear QDs hidrofílicos ao interior de células vivas. Primeiramente QDs de CdTe aniônicos foram encapsulados em lipossomas de fosfatidilcolina, catiônicos (contendo DOTAP) e fusogênicos (contendo DOPE, DOTAP e DPPE-Rh). A análise por microscopia de fluorescência de hemácias e células tronco incubadas com os lipossomas fusogênicos contendo os QDs negativos, evidenciou que os QDs ficaram ligados à membrana celular devido à diferença de cargas negativas dos QDs e positivas dos lipídeos. Portanto, na continuidade deste trabalho uma segunda abordagem, baseada na método de injeção em etanol, foi desenvolvida para a encapsulação de QDs e aplicada para os mesmos tipos de lipossomas anteriormente descritos. Nessa segunda metodologia, os QDs de CdTe positivos foram também utilizados, de forma a evitar a interação eletrostática entre os QDs e os lipídeos. Para ambos os métodos desenvolvidos, os lipossomas foram caracterizados por medidas de potencial zeta, de raio hidrodinâmico, microscopia de fluorescência e eletrônica de transmissão, confirmando que houve a encapsulação de QDs para todos os sistemas lipossomais utilizados. Ao longo de todo o estudo as hemácias foram células modelo importantes para avaliar a fusão dos lipossomas com a membrana celular, pois estas não apresentam atividade endocítica. Os lipossomas de fosfatidilcolina e catiônicos serviram de modelo para desenvolver as duas metodologias de encapsulação que posteriormente foram aplicadas aos fusogênicos. Os estudos feitos com hemácias e células HeLa, utilizando a segunda metodologia de encapsulação e lipossomas fusogênicos, sugerem a entrega dos QDs positivos nas células vivas. No entanto, estudos adicionais precisam ser desenvolvidos para comprovar se os QDs positivos se encontram livres ou não no citosol. Este novo método apresenta ainda potencialidade para a encapsulação de QDs bioconjugados, pois o processo de congelamento do anterior poderia desnaturar as proteínas. Esperamos que este estudo possa ajudar no desenvolvimento de métodos efetivos de liberação de QDs no citosol, de forma que seja possível se utilizar as vantagens dessas sondas fluorescentes para melhor compreender vários processos intracelulares.