Produção, caracterização e purificação parcial de uma nova β-Galactosidade produzida por Cladosporium tenuissimum URM 7803 - PAULO, Anderson José (2018)
A β-galactosidase (EC3.2.1.23) é classificada como uma hidrolase, e realiza reações de catalisação a partir do resíduo terminal β-galactopiranosil da lactose (Galβ1-4Glc) para formar glicose e galactose. Esta enzima se destaca na indústria de alimentos e farmacêutica, sendo utilizada para hidrólise da lactose e produção de produtos destinados a intolerantes à lactose, além de ser usada na síntese de galacto-oligossacarídeos (GOS). Neste sentido, este trabalho objetiva a produção, caracterização e purificação parcial de uma nova β-galactosidase produzida por um isolado da espécie Cladosporium tenuissimum URM 7803. O sequenciamento genético do fator de alongamento e tradução (TEF-1) apresentou 88% de suporte para a espécie C. tenuissimum URM 7803 dentro do complexo de espécies C. cladosporioides. Após confirmação da espécie, a produção de β-galactosidase por C. tenuissimum URM 7803 foi realizada utilizando fermentação líquida conduzida a 28 °C, pH 6.5 e 180 rpm por 312h. Um sistema de duas fases aquosas composto por polietilenoglicol-citrato (SDFA–PEG-Citrato) foi feito por planejamento fatorial 2⁴, utilizando como variáveis a massa molar do PEG (400, 3350 e 8000); concentração do PEG (g/L) (20, 22 e 24); concentração de citrato (g/L) (15, 17,5 e 20) e pH (6, 7 e 8). Os resultados mostraram que a maior produção volumétrica de β-galactosidase (462,13 U/mL) ocorreu em 264h. No SDFA-PEG/Citrato o ensaio 2 (MM-PEG 8000, %PEG 20, %citrato 15 e pH 6,0) apresentou um valor significativo de fator de purificação (FP) de 12,82, e a produção da enzima nessas condições foi selecionada para a etapa de caracterização enzimática. A caracterização do extrato bruto e do extrato parcialmente purificado por SDFA, demonstrou respectivamente temperatura e pH ótimos de 35-60º C e 3,0-4,5 para o extrato bruto e, 40-60º C e 3,0-4,5 para o extrato parcialmente purificado. O íon Fe²⁺ aumentou em 38% a atividade enzimática do extrato parcialmente purificado, e os íons Zn²⁺, Cu²⁺ e Co²⁺ reduziram em média, 25% da atividade. Em relação ao efeito dos inibidores e detergentes a atividade enzimática foi aumentada ou mantida, exceto para o Fenilmetilsulfonilflúor (PMSF) que reduziu em 20 e 12% a atividade no extrato bruto e parcialmente purificado, respectivamente. Pode-se concluir que a nova β-galactosidase produzida por C. tenuissimum URM 7803 foi parcialmente purificada pelo SDFA PEG-Citrato, sendo o primeiro estudo utilizando este tipo de sistema para purificação de β-galactosidase, além de ter apresentado boa atividade enzimática durante sua caracterização físico-química, sendo necessário novos estudos para aumentar o grau de pureza.