Construção, caracterização, antigenicidade e imunogenicidade de proteína multiepítopo dos Alphaherpesvirus bovinos 1 e 5

• Ano de defesa: 2025
• Autor(a) principal: Botton, Nadálin Yandra
• Orientador(a): Fischer, Geferson
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Pelotas
• Programa de Pós-Graduação: Programa de Pós-Graduação em Veterinária
• País: Brasil
• Palavras-chave em Português: Herpesvirus bovinos; Bioinformática; Vacina multiepítopo; Diagnóstico; Glicoproteínas; Bovine herpesviruses; Bioinformatics; Multiepitope vaccine; Diagnosis; Glycoproteins
• Área do conhecimento CNPq: CIENCIAS AGRARIAS
• Link de acesso: http://guaiaca.ufpel.edu.br/xmlui/handle/prefix/18665

Os herpesvirus bovinos são importantes microrganismos causadores de distúrbios respiratórios, reprodutivos e encefálicos que ainda acometem as criações de bovinos em todo o mundo, podendo também afetar bubalinos, ovinos e caprinos. A vacinação é o método mais efetivo de controle e redução das doenças provocadas por esses microrganismos, e nesse âmbito, diferentes plataformas vacinais têm sido desenvolvidas ao longo dos anos com essa finalidade. O objetivo deste estudo foi o desenvolvimento de uma proteína multiepítopo a partir da união de epítopos imunodominantes das glicoproteínas B, C e D dos BoAHVs 1 e 5, e sua avaliação para utilização em teste diagnóstico e vacinação de bovinos sob condições de campo. Inicialmente foi realizada a recuperação (NCBI) e curadoria (MUSCLE e BLASTp) das sequencias das glicoproteínas dos organismos de interesse, para posterior predição de epítopos reconhecidos por linfócitos B (BepiPred 2.0), células T citotóxicas (NetMHCpan EL 4.1) e células T helper (NetMHCIIpan 4.0). Posteriormente à análise de antigenicidade (VaxiJen 2.0), a proteína multiepítopo, que daria origem à vacina multiepítopo, foi montada utilizando os ligantes GGGGS e EAAAK entre os epítopos de uma mesma glicoproteína ou entre os epítopos de glicoproteínas diferentes, respectivamente. Após, as análises de parâmetros físico-químicos e perfil de alergenicidade, foram realizadas através dos servidores ProtParam e AlgPred seguida de uma nova análise de antigenicidade (VaxiJen 2.0). A modelagem e o docking molecular foram realizados através dos servidores I-TESSER e ClusPro, respectivamente, com o modelo do receptor TLR bovino obtido através do banco de dados AlphaFoldDB. Para a expressão da proteína multiepítopo o vetor pET24a contendo o gene de interesse foi utilizado para transformar a cepa de E. coli BL21 (DE3) Star por choque térmico. O cultivo foi realizado em 500 mL de meio LB líquido sob condições ideias para o seu crescimento e expressão da proteína multiepítopo. Em seguida a amostra foi processada e em sequência purificada por cromatografia de afinidade no equipamento AKTA Purifier, para posterior diálise e quantificação por BCA. A caracterização foi realizada por Western blotting e a antigenicidade por teste de ELISA indireto com protocolo in house. A imunogenicidade foi avaliada a partir da imunização de 5 bovinos com 400 µg da proteína multiepítopo conjugada com o adjuvante Montanide™ ISA 50 V2, pela via intramuscular (vacina multiepitopo). O grupo placebo foi inoculado com solução salina tamponada (PBS). Para determinação do nível de anticorpos totais IgG, o teste de ELISA indireto, com protocolo in house, foi empregado. A proteína multiepítopo apresenta 321 aminoácidos, peso molecular de 33.24 kDa, pI teórico de 9.88, estimativa de meia vida em E. coli de >10 horas, GRAVY de -0,507, antigenicidade de 1.1543 e se caracteriza como instável e sem potencial alergênico. A proteína multiepítopo também é capaz de interagir com alta energia de interação (-1264.7 kcal/mol) com 88 membros do cluster. Suas frações solúvel e insolúvel foram reconhecidas pelo anti-HIS6x em um Western blotting, caracterizando-a pelo seu peso molecular de ~33 kDa. A proteína multiepítopo foi fortemente reconhecida pelos anticorpos IgG-anti-alphaherpesvirus dos soros bovinos, demonstrando sua antigenicidade. A vacina multiepitopo foi capaz de induzir uma resposta imunológica humoral a nível de IgG total. A proteína multiepítopo pode ser utilizada em testes diagnósticos e em vacinas contra os Alphaherpesvirus bovinos 1 e 5.