Expressão e caracterização de uma forma N-Truncada da proteína Nifa de Azospirillum Brasilense - Nishikawa, Caroline Yuki (2010)
Resumo: Azospirillum brasilense é uma bactéria fixadora de nitrogênio que se associa com diversas plantas agrícolas de interesse comercial como o arroz, o milho e o trigo. É muito estudado por seu potencial como biofertilizante, podendo reduzir a utilização de fertilizantes químicos nitrogenados e consequentemente os danos ao meio ambiente, como a eutrofização de rios e a acidificação do solo. Neste microrganismo os genes responsáveis pela fixação de nitrogênio (genes nif) necessitam de uma proteína ativadora transcricional, a NifA. A proteína NifA tem sua atividade regulada pelos níveis de oxigênio e de íons NH4+ e possui três domínios funcionais. O domínio N-terminal é responsável pelo controle negativo dos níveis intracelulares de nitrogênio; o domínio central interage com o fator sigma-54 da RNA polimerase e possui um motivo de hidrólise de ATP e o domínio C-terminal possui um motivo hélice-volta-hélice responsável pela ligação da proteína ao DNA. Esses domínios são interligados por regiões interdomínio QL (N-terminal e Central) e IDL (Central e C-terminal). Na extremidade final do domínio central e início do interdomínio IDL há um motivo conservado de resíduos de cisteínas provavelmente envolvidos na sensibilidade da proteína ao oxigênio. Neste trabalho a proteína NifA de A. brasilense foi expressa e purificada em uma forma N-truncada fusionada a uma cauda contendo resíduos de histidina e caracterizada em ensaios de ligação ao DNA in vitro e de ativação transcricional in vivo. A proteína recombinante His-NifA N-truncada purificada atingiu 80% de pureza com rendimento de 0,43mg de proteína por litro de cultura. A proteína purificada foi capaz de se ligar à região promotora do gene nifB de Herbaspirillum seropedicae. Ensaios in vivo com a proteína NifA N-truncada contendo ou não cauda de histidina mostraram capacidade de ativar o promotor nifH de Klebsiella pneumoniae a partir de uma fusão nifH::lacZ na ausência de oxigênio. Nossos resultados também indicaram que a NifA N-truncada de A. brasilense parece ser menos sensível ao oxigênio que a NifA N-truncada de H. seropedicae.