Promoter-specific expression of the imprinted IGF2 gene in bovine oocytes and preimplantation embryos - Willhelm, Bruna Rodrigues (2018)
O splicing de precursores de RNA mensageiro para mRNA maduro é um componente crítico da regulação gênica. O processo pode codificar proteínas distintas ou afetar a estabilidade, localização e tradução de mRNAs. Já foram descritas diversas correlações entre uma maior mortalidade embrionária precoce, principalmente em embriões de produzidos in vitro (PIV), que apresentavam retardo de crescimento do concepto e expressões reduzidas de IGF2 com anormalidades placentárias e fetais durante a fase fetal. O locus IGF2 é uma região genômica complexa que produz múltiplos transcritos com splicing alternativos, a partir de vários exons distintos controlados por quatro promotores diferentes. O presente estudo explorou a expressão dos diferentes promotores do IGF2 em oócitos bovinos e embriões bovinos em estádios de pré-implantação, no intuito de esclarecer alguns aspectos da fisiologia do desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro (PIV). Para descrever o comportamento do gene IGF2, estruturas de PIV em vários estádios de desenvolvimento, desde oócitos imaturos até blastocistos expandidos, foram produzidas e coletadas em três rotinas, em pools de cinco estruturas por estádio. O RNA total foi extraído dos pools e submetido à transcrição reversa para a obtenção de cDNA, o qual foi utilizado para estimar a abundância das quatro isoformas de mRNA para o IGF2 por PCR quantitativo em tempo real (qPCR), utilizando inicializadores específicos para cada promotor do gene IGF2. Os produtos de amplificação foram submetidas ao sequenciamento de DNA para confirmação molecular. Os dados de expressão quantitativa das isoformas do IGF2 foram transformados em log para a normalização, foram analisados pelo Mixed Procedure do SAS, com comparações pareadas por LSM, para P<0,05. A expressão dirigida pelos promotores P2 e P4 seguiram o padrão observado no mRNA ativo do gene IGF2. Um pico inicial pôde ser visto em estádios precoces, entre oócitos maturados e o estádio embrionário de 2-células, principalmente causada por uma expressão materna e acumulação de transcritos antes da fecundação, seguido por uma diminuição da quantidade de transcritos até a ativação do genoma embrionário, no estádio embrionário de 8-células. Então, um novo aumento dos transcritos pôde ser detectado na compactação e cavitação embrionária. A expressão dirigida pelo promotor P1 do IGF2 mostrou-se menos representativo nas fases iniciais, havendo aumento durante a compactação, após a ativação genômica, prévia à cavitação. Diferentemente, a atividade do promotor P3 não foi detectada em embriões, estando possivelmente presente apenas em estádios mais avançados de desenvolvimento. Futuros estudos genéticos focados no desenvolvimento embrionário inicial devem prestar especial atenção ao papel da expressão do promotor P4 do gene IGF2, com os promotores P1 e P2 tendo um aparente papel secundário no desenvolvimento inicial, enquanto o promotor P3, se geneticamente manipulado, poderia trazer mudanças fisiológicas somente posteriormente no desenvolvimento. Os achados deste estudo fornecem uma compreensão adicional da biologia do desenvolvimento de embriões derivados de PIV, bem como novas possibilidades para o uso da expressão dos diferentes promotores do gene IGF2 para a manipulação genética durante estádios preimplantacionais de embriões bovinos, o que pode ser um caminho para estudos que visam o aumento da viabilidade e a redução da mortalidade embrionária no início da gestação pela modulação da taxa de crescimento após a produção embrionária in vitro.