Edição genômica por CRISPR/Cas9 para as mucopolissacaridoses de modelos celulares ao desenvolvimento de novas terapias - Poletto, Édina (2021)
A edição genômica consiste na modificação precisa de sequências de DNA. Com o intuito de desenvolver modelos celulares para as mucopolissacaridoses do tipo I e II (MPS I, MPS II), doenças causadas por deficiências em enzimas, gerando acúmulo de glicosaminoglicanos (GAGs), utilizamos o sistema CRISPR/Cas9 para induzir mutações em células HEK293. Obtivemos células nocautes para ambas as doenças, com níveis indetectáveis de enzima e acúmulo significativo de GAGs. Com a mesma metodologia, criamos um modelo de MPS II utilizando células SH-SY5Y, que constituem um modelo relevante para estudos fisiopatológicos. Nestas células, observamos alterações morfológicas condizentes com o fenótipo de MPS II, como aumento de autolisossomos e de mitocôndrias. Ao serem diferenciadas em neurônios, as células apresentaram densidade de neuritos diminuída. Além da geração de modelos celulares, a edição genômica pode ser a peça principal de novos produtos de terapia. Utilizando CRISPR/Cas9 e um vetor viral, editamos eficientemente células-tronco hematopoiéticas humanas saudáveis para superexpressarem alfa-Liduronidase, a enzima ausente na MPS I. Ao serem transplantadas em camundongos MPS I imunocomprometidos e pré-condicionados com bussulfano, as células editadas enxertaram eficientemente, chegando a mais de 90 % de quimerismo humano em alguns animais. Isso culminou na correção completa dos parâmetros bioquímicos avaliados nos tecidos viscerais. O uso de bussulfano, em comparação com a irradiação, aumentou significativamente a migração de células editadas ao sistema nervoso central, demonstrada pela atividade enzimática superior, com redução significativa de GAGs. Demonstramos, assim, que a edição genômica para terapia genica ex vivo é muito eficaz e promissora, com poucas lacunas a serem preenchidas em estudos pré-clínicos antes da tradução aos pacientes. Uma delas é a avaliação da eficácia e segurança em modelos animais imunocompetentes. Com vistas à continuidade do estudo, avaliamos e definimos o melhor protocolo de transplante em camundongos neonatos, cuja via de administração que apresenta maior alcance das células no cérebro foi definida como sendo a via retro-orbital. Conjuntamente, demonstramos que a edição genômica contribui não só para o estudo da fisiopatologia das doenças, como também pode atuar como agente terapêutico, sendo utilizada com eficiência em protocolos de terapia gênica.