Clonagem e expressão da urease da bactéria diazotrófica Azospirillum brasilense FP2 e do peptídeo soyuretox, derivado da urease ubíqua de soja (Glycine max) - Kappaun, Karine (2014)
Ureases (ureia amido-hidrolases; EC 3.5.1.5) são enzimas níquel dependentes, amplamente distribuídas em bactérias, fungos e plantas, que catalisam a hidrólise da ureia à amônia e a dióxido de carbono. Em plantas e fungos, as ureases são hexâmeros formados por subunidades idênticas. Em bactérias, as ureases são formadas por duas ou três subunidades distintas, como é o caso em Helicobacter pylori e Azospirillum brasilense, respectivamente. As bactérias do gênero Azospirillum são microrganismos diazotróficos (capazes de fixar nitrogênio atmosférico), encontrados no solo e em associação com raízes de plantas como o arroz, o trigo e o milho. A principal função da urease em plantas parece estar relacionada à reciclagem do nitrogênio, mas diversas atividades biológicas que independem da atividade ureolítica têm sido demonstradas, sugerindo que esta possa estar envolvida na defesa da planta contra insetos e fungos. A fim de estudar esta enzima, a primeira parte do trabalho objetivou obter a urease recombinante de Azospirillum brasilense FP2. Para isso, o inserto foi clonado no vetor pET-23a por recombinação homóloga in vivo. Seis aminoácidos mostraram-se diferentes, em relação a sequência de proteínas predita do A. brasilense sp245, o que parece diferença entre as cepas de A. brasilense sp245 e FP2. A expressão da enzima recombinante foi otimizada, seguida de purificação feita por cromatografia de afinidade a níquel. No segundo capítulo desse trabalho é apresentada a clonagem, a expressão do gene e a purificação de um peptídeo derivado da urease ubíqua de soja. Esse peptídeo, denominado soyuretox, é colinear com o jaburetox, uma peptídeo recombinante derivado da urease de Canavalia ensiformis. Dados prévios do nosso laboratório demonstram diversas propriedades biológicas do jaburetox, tais como atividade inseticida, capacidade de interagir com bicamadas lipídicas, efeito fungitóxico, dentre outras. Estudos comparativos com o soyuretox mostraram que esse peptídeo apresenta toxicidade para duas leveduras testadas, Candida tropicalis e Saccharomyces cerevisiae.