Análise da diversidade molecular em Araucaria angustifolia a partir de sequências de microRNAs e do cloroplasto - Galdino, José Henrique (2018)
Araucaria angustifolia, popularmente conhecida como Pinheiro do paraná, é a principal conífera endêmica do Brasil com importância comercial, destacando-se como a principal espécie madeireira da região Sul do país no século passado. Por apresentar madeira de excelente qualidade e alto valor comercial, esta espécie foi alvo de extrativismo predatório durante décadas, sofrendo um decréscimo populacional acentuado. Atualmente, A. angustifolia é classificada como espécie criticamente ameaçada de extinção. Esta espécie tem sido alvo de diversos estudos genéticos, principalmente com foco em embriogênese somática. Recentemente, uma análise transcriptômica em estágios iniciais de desenvolvimento foi realizada a partir de dados de RNA-seq, os quais encontram-se disponíveis no NCBI. No presente estudo, esses dados foram utilizados em novas análises a fim de se obter novos recursos genéticos e genômicos em A. angustifolia. No primeiro capítulo, o transcriptoma do Pinheiro do paraná foi analisado com foco na identificação de miRNAs. Este é o primeiro estudo baseado na identificação e análise de pequenos RNAs em uma espécie da família Araucariaceae. A busca por miRNAs conservados no Pinheiro do paraná resultou na identificação de 115 sequencias representativas de 30 famílias. Um total de 106 precursores de miRNAs foram preditos, dos quais, 41 correspondem a miRNAs conservados de 16 diferentes famílias, e 65 foram anotados como novos miRNAs. A comparação das sequencias de pre-miRNAs do pinheiro do paraná com bibliotecas de pequenos RNAs de outras cinco espécies de gimnospermas indicou que 9 dos 65 novos miRNAs são conservados em gimnospermas, enquanto que 56 possivelmente são específicos do Pinheiro do paraná, do gênero Araucaria, ou da família Araucariaceae. Em outra análise comparativa, onde as sequências dos novos pre-miRNAs do Pinheiro do paraná foram alinhadas com unigenes do transcriptoma de A. cunninghamii, sete ortólogos foram identificados nessa espécie congenérica da Oceania. Uma série de miRNAs identificados por análises computacionais de predição foi validada experimentalmente através da técnica de stem-loop RT-qPCR. Nessa análise, os padrões de expressão de miRNAs novos e conservados foram analisados em cinco tecidos distintos coletados de plantas com 90 dias de crescimento. No segundo capítulo, os dados públicos de RNA-seq foram usados para determinar a sequência completa do genoma de cloroplasto (cpDNA) de A. angustifolia. O cpDNA do Pinheiro do paraná tem 146.203 pares de bases de comprimento, e abriga 122 genes, dos quais, 80 codificam 9 polipeptídios, 5 codificam RNAs ribossômicos e 37 codificam RNAs de transferência. As regiões codificantes totalizam 45,02%, sendo que 4,96% equivalem a rRNAs e tRNAs. Os genes normalmente localizados nas repetições invertidas (IRs) estão presentes em cópias únicas, com exceção dos genes rrn5 e tRNA-CAU. A estrutura típica encontrada no cpDNA de vários grupos de plantas terrestres, LSC/IR/SSC/IR, não está presente no plastoma de A. angustifolia. Análises filogenéticas baseadas no método Bayesiano e Mássima Verossimilhança, com unanimidade e alto suporte estatístico, agruparam A. angustifolia com as espécies congenéricas A. heterophylla e A. columnaris. Análises computacionais de predição de microssatélites indicaram que o cpDNA de A. angustifolia apresenta 100 SSRs, dos quais 14 correspondem a loci de tetranucleotídeos. O presente estudo apresenta aspectos importantes em relação à composição, evolução e diversidade de miRNAs de A. angustifolia, uma espécie da família Araucariaceae criticamente ameaçada de extinção. Além de novos recursos genéticos resultantes da identificação de miRNAs, o presente trabalho também apresenta novos recursos genômicos em A. angustifolia, com a montagem e anotação do genoma de cloroplasto. O cpDNA de A. angustifolia apresenta importantes características que podem ser exploradas em diferentes aspectos, como estudos de diversidade populacional, estudos filogenéticos, entre outros.