Expressão de fatores de transcrição recombinantes de Mycoplasma hyopneumoniae - Mucha, Scheila Gabriele (2013)
Mycoplasma hyopneumoniae é uma das menores bactérias presentes na natureza, apresentando um genoma reduzido com alto conteúdo de A+T e ausência de parede celular. Este organismo é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína, uma doença crônica que afeta rebanhos em todo mundo sendo responsável por grandes perdas econômicas. Para investigar a patogênese de M. hyopneumoniae é importante entender seus mecanismos genéticos, porém, apesar do sequenciamento do genoma de várias linhagens (7448, J, 232 e 168), pouco se sabe sobre os mecanismos que regulam e controlam a expressão gênica neste microrganismo, principalmente no que se relaciona às proteínas regulatórias. Os fatores de transcrição são proteínas que se ligam ao DNA e propiciam a capacidade de controlar a expressão gênica sob diferentes estímulos metabólicos ou condições de crescimento. O conhecimento que se tem sobre essas proteínas em M. hyopneumoniae é escasso, então, desta forma, este trabalho tem como objetivo a análise de potencias fatores de transcrição de M. hyopneumoniae. Para isso foram selecionadas proteínas tradicionalmente descritas em bancos de dados como fatores de transcrição (HrcA – MHP7448_0010; transcriptional regulator – MHP7448_0279; e a proteína hipotética MHP7448_0551), além de uma proteína hipotética que apresenta similaridades estruturais com fatores sigma (MHP7448_0639). Estas proteínas foram clonadas por recombinação homóloga in vivo no vetor de expressão pGEX 4T1 e transformadas em Escherichia coli para expressão das proteínas recombinantes. Porém, para empregar essa técnica foi necessário realizar a mutagênese sítio-dirigida para a substituição do códon UGA (triptofano em micoplasmas) para UGG (triptofano no código genético universal) nas proteínas que apresentavam este códon. As mutações foram inseridas através da técnica de overlap extension PCR, utilizando primers mutagênicos. Foram obtidos clones para três proteínas (MHP7448_0551, MHP7448_0639 e MHP7448_0010), que foram eficientemente expressas em E. coli. Depois de solubilizadas com 0,5% de sarcosil, essas proteínas foram submetidas a um processo de purificação por cromatografia de afinidade. A purificação foi bem sucedida para duas das três proteínas testadas, e novos testes serão realizados com a proteína ainda não purificada (MHP7448_0010). Uma vez purificados, os potenciais fatores de transcrição serão utilizados na identificação das regiões do DNA que essas proteínas regulam e que estão envolvidas no controle da expressão gênica em M. hyopneumoniae.