Efeito periférico da isquemia cerebral transitória de radicais livres : um estudo da atividade das enzimas ATP difosfoidrolase (EC 3.6.1.5) e 5'nucleotidase (EC 3.1.3.5) de plaquetas de ratos adultos e do estresse oxidativo plasmático - Frassetto, Silvana Soriano (1998)
O nosso laboratório tem demonstrado que plaquetas de ratos expressam uma ectoenzima denominada ATP difosfoidrolase (EC 3.6.1.5) que hidrolisa ATP e ADP até AMP. Um possível papel fisiológico para esta enzima seria a participação em uma cadeia enzimática juntamente com uma 5'-nucleotidase (EC 3.1.3.5) para a hidrólise completa do ATP até adenosina na circulação. Assim, a ATP difosfoidrolase hidrolisa ATP e ADP até AMP e a 5'nucleotidase hidrolisa AMP até adenosina. Enquanto que o ATP e o ADP são descritos como nucleotídeos ativos nos vasos sanguíneos, sendo que o ADP é um fator de agregação plaquetária; a adenosina é um vasodilatador e inibidor da formação de microtrombos. Considerando que a ATP difosfoidrolase e a 5'-nucleotidase são importantes para a degradação de ATP, ADP e AMP e, possivelmente, para a formação de adenosina, a alteração destas atividades enzimáticas pode representar um fator que contribui para a injúria vascular em mecanismos patológicos associados aos radicais livres. Nós demonstramos o efeito in vitro de radicais livres nas atividades da ATP difosfoidrolase e da 5'-nucleotidase de plaquetas de ratos. As plaquetas foram expostas a um sistema que forma radicais livres sendo que estas enzimas foram inibidas. A inibição enzimática não aconteceu quando adicionamos glutationa (GSH) e cisteína no meio de incubação. Os resultados indicam que tióis plasmáticos de peso molecular baixo são importantes para a defesa contra a injúria causada pelos radicais livres sobre estas enzimas. Como a nossa proposta é que a ATP difosfoidrolase e a 5'-nucleotidase regulam a concentração de nucleotídeos no microambiente plaquetário, a nossa hipótese é que o metabolismo de nucleotídeos e, consequentemente, a formação de adenosina por estas enzimas podem ser alterados por radicais livres levando à formação de microtrombos cardíacos e cerebrais em doenças vasculares como a isquemia. Estudos têm mostrado que pacientes com doença cerebrovascular isquêmica apresentam formação de microtrombos periféricos. Além disso, a isquemia cerebral causa a morte de neurônios vulneráveis devido à excitoxicidade e ao estresse oxidativo, sendo que esta injúria é limitada quando o fenômeno de pré-condicionamento isquêmico é induzido. Muitos estudos têm sugerido que há a proteção contra a injúria neuronal após o pré-condicionamento porque um episódio de isquemia breve induz tolerância a episódios isquêmicos mais longos. Como o efeito protetor pelo pré-condicionamento contra a injúria tem sido atribuído à adenosina, é possível que as enzimas envolvidas na formação deste nucleosídeo no sistema nervoso e na circulação participem deste fenômeno como moduladores. A atividade de uma ATP difosfoidrolase de sinaptossomas de hipocampo de ratos tolerantes à isquemia cerebral foi demonstrada no nosso laboratório. No presente trabalho, nós investigamos a hipótese de que a isquemia cerebral transitória e o pré-condicionamento podem alterar o metabolismo de nucleotídeos na circulação periférica. Assim, os efeitos da isquemia cerebral, da reperfusão e do pré-condicionamento foram estudados nas atividades da ATP difosfoidrolase e da 5'-nucleotidase de plaquetas de ratos. Ratos adultos foram submetidos a um único episódio isquêmico (2 ou 10 min), ou a um episódio isquêmico duplo (pré-condicionamento isquêmico = 2+10 min) pelo método de oclusão dos quatro vasos. Ratos não pré-condicionados e pré-condicionados também foram submetidos à reperfusão. Os episódios isquêmicos de 2 ou 10 min inibiram a hidrólise do ATP e do ADP pela ATP difosfoidrolase de plaquetas. Por outro lado, a hidrólise do AMP pela 5'-nucleotidase aumentou depois de 2 min de isquemia, enquanto que com o episódio isquêmico de 10 min não houve efeito. O pré-condicionamento isquêmico ativou ambas as enzimas. Os efeitos da reperfusão foram diferentes para cada grupo experimental. As atividades enzimáticas retornaram aos níveis do controle no grupo que foi submetido a 2 min de isquemia e reperfusão. A atividade da ATP difosfoidrolase permaneceu inibida até 30 dias de reperfusão após 10 min de isquemia. Sessenta minutos e 1 dia de reperfusão após 10 min de isquemia inibiu a atividade da 5'- nucleotidase. Por outro lado, a enzima foi ativada após 10 min de isquemia seguidos de 2 e 5 dias de reperfusão, mas retornou aos níveis do controle depois de 10 e 30 dias. O pré-condicionamento isquêmico cancelou os efeitos dos 10 min de isquemia e da reperfusão sobre as atividades enzimáticas. Os resultados indicam que a isquemia cerebral e a reperfusão alteram a degradação de ATP, ADP e AMP por plaquetas e, provavelmente, a formação de adenosina na circulação. Além disso, o pré-condicionamento isquêmico ativa as enzimas levando a um possível aumento na degradação de ADP e formação de adenosina, e na consequente regulação da formação de microtrombos e do fornecimento de oxigênio ao tecido vascular. Embora a isquemia cerebral cause efeitos periféricos, ainda não foi definido se um provável estresse oxidativo está relacionado a estes efeitos. Entretanto, a ativação plaquetária na doença cardíaca isquêmica parece estar relacionada ao estresse oxidativo. No nosso estudo, sugerimos que a isquemia cerebral e a reperfusão podem causar, juntamente com o estresse oxidativo cerebral e a morte celular, um estresse oxidativo periférico que provavelmente está relacionado às alterações enzimáticas e à formação de microtrombos. Então, o nosso objetivo foi também estabelecer uma relação entre o pré-condicionamento isquêmico cerebral e uma possível proteção contra o estresse oxidativo periférico. Para avaliar esta possível relação, nós analisamos a emissão de quimioluminescência iniciada por tert-butil hidroperóxido e o conteúdo de tióis, como medidas do estresse oxidativo periférico, no plasma de ratos não pré-condicionados e pré-condicionados submetidos à isquemia cerebral produzida pelo método de oclusão dos quatro vasos. Os resultados mostram que 2 e 10 min de isquemia causam um aumento da quimioluminescência plasmática quando comparada aos ratos controle. No grupo que foi submetido a 2 min de isquemia, o efeito não permaneceu após a reperfusão. No grupo que foi submetido a 10 min de isquemia, o aumento permaneceu até 1 dia depois da reperfusão sendo que os valores retornaram aos níveis do controle após 2 dias. Entretanto, a quimioluminescência plasmática de ratos pré-condicionados à isquemia (2+10 min) e à reperfusão não foi diferente quando comparada ao controle. Quando nós analisamos os tióis, houve uma diminuição do conteúdo de tióis plasmáticos depois de 2, 10 min e 2+10 min de isquemia seguidos da reperfusão. Assim, a isquemia causa, juntamente com o estresse oxidativo cerebral e a morte celular, um estresse oxidativo periférico. Os ratos protegidos pelo pré-condicionamento contra a morte neuronal não apresentaram um aumento da quimioluminescência plasmática causado pela isquemia cerebral. Além disso, a diminuição de tióis plasmáticos em todos os grupos que foram submetidos à reperfusão indica que estes podem ser utilizados como antioxidantes. Concluindo, parece que as alterações nas atividades da ATP difosfoidrolase e da 5'-nucleotidase de plaquetas de ratos podem estar relacionadas a mecanismos patológicos associados aos radicais livres como a isquemia cerebral e a reperfusão.