Metabolismo de zinco em Cryptococcus gattii : caracterização de mecanismos regulatórios de transporte - Schneider, Rafael de Oliveira (2012)
Cryptococcus gattii é uma levedura basidiomicética causadora da criptococose, doença que acomete diferentes órgãos de pacientes imunocompetentes, entre eles, pulmões, pele e sistema nervoso central. Durante o processo infeccioso, o fungo expressa diversos fatores de virulência, como a produção de melanina e cápsula polissacarídica, além de possuir a capacidade de replicar-se no interior de macrófagos. Em contrapartida, as células do hospedeiro também possuem estratégias para conter a disseminação do patógeno, uma delas é a imunidade nutricional, na qual ocorre redução da disponibilidade de nutrientes no sítio de infecção. A disponibilidade de zinco é um fator crucial para o desenvolvimento de uma infecção fúngica, mesmo assim, pouco se sabe sobre o metabolismo desse metal na espécie C. gattii. No presente trabalho, primeiramente, descrevemos o fator de transcrição Zap1 em C. gattii, a partir da análise in silico foi identificado um ortólogo do gene regulador da homeostase de zinco ZAP1 de Saccharomyces cerevisiae do genoma de C. gattii. Foram realizadas análises de expressão, demonstrando que o gene selecionado possui sua expressão aumentada na condição de privação de zinco, comprovando assim, sua relação com a homeostase desse metal. Para caracterizar funcionalmente a proteína Zap1, linhagens mutante e mutante complementada para o gene ZAP1 foram construídas e caracterizadas. A diminuição dos níveis de transcritos dos genes codificadores para os transportadores de zinco da família ZIP na linhagem mutante, concluímos que Zap1 regula positivamente a expressão desses genes. Na caracterização fenotípica, a linhagem mutante zap1Δ demonstrou maior sensibilidade à condição de privação de zinco do que a linhagem selvagem e mutante complementada, além de demonstrar altos níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio (EROs) e maior sensibilidade as espécies reativas de nitrogênio (ERNs) características que explicam a menor virulência da linhagem mutante quando comparada com a linhagem selvagem. Por meio da análise do transcriptoma demonstramos que Zap1 regula a expressão de genes envolvidos no metabolismo de zinco, estresse oxidativo e de genes codificadores para proteínas ligadoras de zinco. Secundariamente, na caracterização inicial de sistemas de aquisição de zinco em C. gattii, foram realizadas análises por PCR quantitativo em tempo real para avaliar os níveis de transcritos dos genes que codificam para transportadores de zinco da família ZIP. Um aumento significativo nos níveis de transcritos referentes ao gene ZIP3 (CNBG_5361), foi observado quando C. gattii foi cultivado em meio definido contendo o quelante de ferro BPDS ou o quelante de zinco TPEN, quando comparados à condição controle. Este fato sugere que o transportador Zip3 pode apresentar baixa seletividade, podendo transportar outros metais, em contraste aos transportadores Zip1 e Zip2, cuja modulação da expressão por BPDS foi menos acentuada.