Caracterização do gene OsbHLH35 e dos fatores de transcrição envolvidos na regulação de sua expressão - Fonini, Leila Spagnolo (2017)
As espécies reativas de oxigênio (ERO) são subprodutos usuais do metabolismo aeróbico e estão envolvidas em rotas de transdução de sinal, porém, podem reagir com macromoléculas biológicas causando danos celulares. Portanto, seus níveis devem ser estritamente controlados. Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram que plantas silenciadas nas ascorbato peroxidases citosólicas, APX1 e APX2, possuem níveis aumentados de H2O2, entretanto, essas plantas não apresentam fenótipos de estresse, sugerindo que existe um mecanismo de compensação à diminuição da atividade de APX. Análises de transcriptoma mostraram a expressão diferencial de 58 genes, entre eles, o gene OsbHLH35 teve sua expressão induzida nessas plantas. A caracterização funcional dos genes diferencialmente expressos nessas plantas contendo níveis alterados de peróxido de hidrogênio pode revelar os mecanismos compensatórios induzidos nessas plantas que permitem que as mesmas de desenvolvam normalmente. Além disso, o estudo da regulação da expressão desses genes diferencialmente expressos pode permitir entender como a alteração do estado redox da célula é percebido e transduzido. Dessa maneira, o gene OsbHLH35 foi caracterizado funcionalmente, assim como os fatores de transcrição que regulam a sua expressão, visando a contribuir para a elucidação dos mecanismos de defesa sinalizados pelo peróxido de hidrogênio. A expressão do gene OsbHLH35 foi avaliada em resposta a diferentes estresses, tendo sido demonstrada a modulaçao de sua expressão em resposta à salinidade, à dessecação, ao ABA, à luz UV-B, ao H2O2, e ao frio. No intuito de identificar os fatores de transcrição responsáveis pela regulação da expressão do gene OsbHLH35, um fragmento do promotor foi submetido a experimentos de mono-híbrido em levedura e foram identificados quatro fatores de transcrição como reguladores putativos da sua expressão, OsGRF3, OsGRF4, OsGRF11 e IDEF1. A ligação dos fatores de transcrição ao promotor de OsbHLH35 foi confirmada em ensaios de mono-híbrido, e OsGRF11 foi capaz de reprimir a transcrição do gene repórter em ensaios de transativação. A análise de plantas silenciadas via RNAi nos genes OsGRF3 e OsGRF4 revelou que, além de tamanho reduzido, essas plantas produzem menor número de panículas que as plantas WT. Além disso, plantas superexpressando OsbHLH35 e OsGRF11 foram geradas. Até o momento, as plantas atingiram a fase de florescimento, no entanto, não produziram sementes. O estudo da história evolutiva da família GRF em Viridiplantae revelou que essa família existe pelo menos desde as algas carófitas, tendo sofrido uma expansão nas plantas terrestres, principalmente com duplicações nos ancestrais das monocotileôneas e das eudicotiledôneas, e que eventos de WGD tiveram importância na expansão dessa família. Além disso, sugerimos a origem do GRF ancestral a partir da subunidade SNF2 do complexo de remodelamente da cromativa SWI2/SNF2, provavelmente em uma duplicação no ancestral das carófitas.