Efeitos de metabólitos acumulados na síndrome hiperornitinemia-hiperamonemia-homocitrulinúria sobre a homeostase energética e redox cerebral e o comportamento de ratos - Viegas, Carolina Maso (2012)
doença metabólica hereditária bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de ornitina (Orn), homocitrulina (Hcit), amônia e ácido orótico (Oro) no sangue e outros tecidos dos pacientes afetados. Os sintomas neurológicos desse distúrbio são comuns, incluindo retardo mental, convulsões e ataxia, porém os mecanismos que levam ao dano cerebral são praticamente desconhecidos. O presente estudo teve o objetivo de avaliar o efeito dos metabólitos acumulados nesta doença sobre a homeostase energética e redox em cérebro de ratos, bem como sobre o desempenho de animais submetidos à hiperornitinemia em tarefas comportamentais. Inicialmente avaliamos o efeito in vitro da Orn, Hcit e Oro sobre parâmetros do metabolismo energético em cérebro de ratos jovens. Verificamos que a Orn e a Hcit inibem o ciclo dos ácidos tricarboxílicos, (inibição da produção de CO2 a partir de acetato e das enzimas aconitase e α-cetoglutarato desidrogenase), bem como a via glicolítica aeróbica (redução na síntese de CO2 a partir de glicose), além de comprometer o fluxo de elétrons pela cadeia respiratória (inibição do complexo I-III). A Hcit, mas não a Orn, também foi capaz de inibir a atividade da enzima creatina quinase, sendo que essa inibição foi prevenida por GSH, sugerindo um possível papel de espécies reativas oxidando grupamentos tióis, essenciais para a atividade desta enzima. Em contraste, a atividade das outras enzimas do ciclo dos ácidos tricarboxílicos e da cadeia respiratória, bem como a Na+,K+- ATPase não foram alteradas in vitro pela Orn e pela Hcit nas doses testadas (0,1 a 5 mM). Do mesmo modo, o Oro não interferiu em nenhum dos parâmetros testados. O próximo passo deste estudo foi avaliar o efeito in vivo da administração intracerebroventricular (ICV) de Orn e Hcit sobre parâmetros de estresse oxidativo e metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens. A Orn e a Hcit aumentaram os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e a formação de grupamentos carbonilas, indicativos de peroxidação lipídica e dano oxidativo a proteínas, respectivamente. Além do mais, a N-acetilcisteína e a combinação de ácido ascórbico mais α-tocoferol atenuaram a oxidação lipídica e preveniram totalmente o dano oxidativo protéico provocado pela Orn e pela Hcit, sugerindo que espécies reativas estejam envolvidas nestes efeitos. A administração ICV de Hcit, mas não de Orn, também diminuiu os níveis de glutationa reduzida (GSH), bem como a atividade das enzimas catalase e glutationa peroxidase, indicando que a Hcit provoca uma redução nas defesas antioxidantes cerebrais. Quanto aos parâmetros de metabolismo energético avaliados após a administração ICV de Orn e Hcit, verificamos que a Orn e a Hcit inibem o funcionamento do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (inibição da síntese de CO2 a partir de acetato), a via glicolítica (redução na produção de CO2 a partir de glicose) e a atividade do complexo I-III da cadeia respiratória. A Hcit in vivo também inibiu a atividade da aconitase, uma enzima muito susceptível ao ataque de radicais livres. Investigamos também os efeitos da administração ICV de Orn e Hcit na presença ou ausência de hiperamonemia, induzida pela administração intraperitoneal de urease, sobre parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens. A Orn aumentou os níveis de TBA-RS e a formação de carbonilas, sem alterar o conteúdo de grupamentos sulfidrilas e os níveis de GSH. Além disso, a combinação de hiperamonemia com Orn resultou em uma diminuição no conteúdo de sulfidrilas e GSH, indicando um efeito sinérgico da Orn com a amônia. Além disso, a Hcit causou um aumento nos valores de TBA-RS e da formação de carbonilas, bem como uma diminuição na concentração de GSH sem alterar o conteúdo de sulfidrilas. Em relação ao tratamento com urease, a indução de hiperamonemia pela urease foi capaz de aumentar os níveis de TBA-RS, indicando que hiperamonemia causa dano oxidativo a lipídeos. Finalmente, produzimos um modelo animal quimicamente induzido de hiperornitinemia através da administração subcutânea de Orn (2-5 μmol/g de peso corporal). Altas concentrações cerebrais de Orn foram alcançadas nesse modelo, indicando que a Orn é permeável a barreira hemato-encefálica. Investigamos, então, o efeito da administração crônica de Orn do 5° ao 28° dia pós-natal sobre o desenvolvimento físico, motor e sobre o desempenho dos ratos adultos nas tarefas de campo aberto e no labirinto aquático de Morris. A administração crônica de Orn não afetou o aparecimento de pelos, a abertura dos olhos, a erupção dos incisivos e o reflexo de queda livre, sugerindo que o desenvolvimento físico e neuromotor não foram comprometidos pela administração crônica de Orn. Similarmente, o desempenho dos ratos no labirinto aquático de Morris na idade adulta não foi alterado pelo tratamento crônico dos mesmos com Orn, indicando que a memória espacial não foi afetada. Entretanto, os animais tratados com Orn não apresentaram habituação ao campo aberto, sugerindo um déficit de aprendizado/memória nesta tarefa. A atividade motora, avaliada pelo número de cruzamentos na tarefa do campo aberto, e pela velocidade de natação no labirinto aquático de Morris foram similares para os animais injetados com Orn e salina, indicando que os animais com hiperornitinemia não apresentaram déficit na atividade locomotora que pudesse atrapalhar seu desempenho nos testes de comportamento. De maneira similar, o número de bolos fecais, o número de grooming e o tempo gasto na área central na tarefa de campo aberto foram iguais em ambos os grupos, indicando que não houve alteração na ansiedade dos animais com o tratamento com Orn. A presente investigação demonstrou pela primeira vez que a Orn e especialmente a Hcit comprometem a homeostase energética e redox celular e que hiperornitinemia crônica durante o período pós-natal prejudica o desempenho de animais adultos na tarefa de campo aberto. É provável, portanto, que as concentrações cerebrais aumentadas de Orn tenham provocado um dano cerebral, possivelmente através do comprometimento do metabolismo energético e da indução de dano oxidativo, alterando vias do metabolismo necessárias para um aprendizado/memória normais. Concluindo, postulamos que alterações na bioenergética e no estado redox cerebral induzido pelos metabólitos acumulados na síndrome HHH, como demonstrado in vitro e in vivo na presente investigação, possam representar mecanismos patogênicos, contribuindo, ao menos em parte, para os sintomas neurológicos dos pacientes afetados por este transtorno.