Estudo da mobilização de transposons através de transformação genética - Deprá, Maríndia (2005)
A mobilização dos elementos de transposição (TEs) está sujeita a um conjunto complexo de mecanismos regulatórios que envolvem não apenas proteínas codificadas pelos próprios transposons, mas também pela célula hospedeira. Entretanto, até o momento, se conhece pouco sobre os fatores que levam à mobilização de TEs nos genomas hospedeiros. De uma maneira geral, fatores que expõem um organismo a situações de estresse levam à mobilização de transposons. Em função disso, propomos a adaptação, a nossas condições de laboratório, de uma metodologia de transformação genética para ser utilizada como ferramenta, na tentativa de contribuir na elucidação dos mecanismos de mobilização do elemento transponível hobo. Para o estabelecimento desta metodologia utilizamos como ferramentas um microscópio óptico binocular e um micromanipulador adaptado LEITZ. Neste micromanipulador foi acoplado um sistema de compressão a ar, composto por uma seringa de vidro de 20 ml e um dispositivo para infusão endovenosa (butterfly), onde é encaixada uma ponteira de micropipeta. Na ponteira, foi colada, com adesivo instantâneo, uma agulha feita a partir de capilares de vidro. O processo de microinjeção ocorreu em uma lâmina de microscopia contendo uma fita adesiva dupla-face que serve de suporte para os ovos a serem injetados. Com o auxílio de uma agulha histológica, ovos do mutante white de Drosophila simulans, previamente desidratados, foram decorionados manualmente e colocados enfileirados sobre este suporte para evitar deslocamentos durante a injeção. Posteriormente, os embriões foram imersos em “óleo de halocarbono”, e, em seguida, foi realizada a microinjeção de DNA. Para esta etapa do trabalho foram testados vários vetores de transformação, sendo mais eficaz o elemento transponível piggyBac, com o vetor pBac[3xp3-GFPafm], o qual possui um promotor que conduz uma forte expressão da proteína GFP (Green Fluorescent Protein) em tecidos do olho de moscas adultas, o que, sob luz laser azul, fluoresce com uma intensa cor verde. Com este vetor conseguimos a detecção de transformantes, e a comprovação da eficiência da metodologia estabelecida. A segunda etapa do trabalho teve como objetivo estudar a mobilização do transposon hobo por meio de microinjeção de DNA. Para isso foram utilizados os mutantes white, cuja mutação é causada pela inserção do elemento hobo “relic” (hoboVA) neste gene, e dpp-like de D. simulans. Como vetor de transformação foram utilizados, independentemente, os plasmídeos pHFL1 (hobo canônico), e BlueScript como controle. Os adultos microinjetados sobreviventes (G0) foram individualmente cruzados com outro da mesma linhagem, e, a partir deste cruzamento, foram estabelecidas cinco isolinhagens de cada G0 acompanhadas até a 3ª geração. Todos os indivíduos foram analisados quanto ao fenótipo, para possíveis eventos de reversão de mutação, e alguns, analisados molecularmente por Southern Blot. Foram observadas diversas alterações morfológicas, essencialmente nas asas, tanto em G0 como em seus descendentes. Na linhagem dpp-like foram observados eventos de reversão ao fenótipo selvagem, porém, essa característica não foi transmitida à descendência, indicando ausência de mobilização do elemento hobo, pelo menos em células germinativas. Para o mutante white, nenhum processo de reversão foi observado, sendo o número de indivíduos com alteração de asas menos pronunciado. No entanto, foi possível isolar uma nova isolinhagem dpp-like, provavelmente fruto de uma inserção de novo no gene dpp. Na análise molecular foi detectada a mobilização do elemento hobo em duas isolinhagens de dpp-like de um total de 27 isolinhagens analisadas, sugerindo uma taxa de mobilização do hobo canônico de 7,4%. Entretanto, não foi possível observar a mobilização de hoboVA através da reversão das mutações white e dpp-like. Isso mostra que a taxa de mobilização desse elemento deve ser inferior à do hobo canônico, e sugere que deve haver um mecanismo de regulação de transposição em hobo.