Caracterização molecular de mutações em pacientes com doença de von Willebrand tipo 3 - Ornaghi, Ana Paula Maciel (2019)
O Fator von Willebrand (FvW) humano é uma glicoproteína plasmática, sintetizada nos megacariócitos e células endoteliais, que circula no plasma sob a forma de multímeros. O gene codificante do FvW está localizado no braço curto do cromossomo 12 e contém 178 kb distribuídos em 52 éxons. O FvW participa tanto da hemostasia primária, ligando-se ao tecido lesionado e recrutando plaquetas, quanto na hemostasia secundária estabilizando a molécula de FVIII, impedindo que esta seja degradada. O gene do VWF é transcrito em um mRNA de 9kb e é traduzido em um pré-pro-polipeptídeo contendo 2813 aminoácidos, sendo composto por uma pré-sequência, um pro-peptídeo e um monômero. Os processos pós traducionais do FvW incluem dimerização, glicosilação, sulfatação, clivagem do pró- peptídeo e multimerização; seguido de estocagem ou secreção. Os níveis plasmáticos normais de FvW, na população em geral, variam de 35 a 200 UI/dL. A doença de von Willebrand (DvW) é causada por anormalidades quantitativas ou qualitativas no FvW. Defeitos quantitativos causam a DvW tipo 1 e tipo 3. Por outro lado, anormalidades qualitativas causam a DvW tipo 2, que pode ser subdividida em tipos 2A, 2B, 2M e 2N. A DvW tipo 3 é uma deficiência quantitativa grave do FvW e é herdada de maneira autossômica recessiva. Os indivíduos com DvW tipo 3, apresentam níveis indetectáveis de FvW:Ag e também níveis muito baixos de FVIII. Pessoas com DvW tipo 3 podem apresentar sintomas clínicos como sangramentos mucocutâneos graves ou moderados, hematomas musculares e hemartroses. O grande tamanho, a sequência altamente polimórfica e a presença de um pseudogene complicam o rastreamento de variantes patogênicas no VWF. O presente estudo visa a caracterização molecular de mutações em pacientes com DvW3 no Rio Grande do Sul. O gene VWF foi sequenciado em 26 casos diagnosticados com DvW3 por sequenciamento de nova geração usando IonTorrent. O impacto das mutações de sentido trocado encontradas foi analisado utilizando 5 algoritmos: Mutationtaster, PROVEAN, SIFT, Polyphen-2 e HOPE. O sequenciamento por Sanger foi realizado para confirmar algumas mutações encontradas pelo método de NGS. O gene do VWF foi amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR) usando 52 pares de primers. As sequências foram alinhadas com a sua referência (NM_000552.4) usando o software CodonCodeAligner implementado no MEGA 5.04. Foram identificadas 72 variantes diferentes: 31 intrônicas, 17 sinônimas, 16 sentido trocado, 6 deleção-inserção, 2 sem sentido. As mutações foram distribuídas em todo o gene, tendo maior prevalência no exon 28 (11%). Cinco novas mutações foram encontradas: c.6976 + 5G> T; c.6885_6886insC; c.3378C> T; c.3346_3347insCCA; c.2503G> T. Vinte e quatro pacientes tiveram mais de uma mutação patogênica que poderia explicar o fenótipo da doença. Dentre elas, 17 pacientes apresentaram as variantes (p.Pro2063Ser e p.Arg324*), a p.Pro2063Ser possui divergências entre ser uma mutação patogênica ou um polimorfismo neutro, então provavelmente a causa da doença nesses pacientes seja a p.Arg324*, que gera um stop códon prematuro. Como 60% dos pacientes apresentaram essa mutação e eles se localizam em regiões próximas do estado do Rio Grande do Sul, podemos sugerir que possa ter havido um efeito fundador, e um haplótipo com outras 13 variantes comuns pra esses 17 pacientes reforça essa hipótese. Usando um painel de sequenciamento de nova geração para o VWF, dentre os 26 pacientes, conseguimos detectar 50 dos 52 alelos em um grupo de pacientes brasileiros com diagnóstico clínico de DvW3. Apesar de todos os pacientes apresentarem sangramento grave, a variação na intensidade do sangramento, tipos de sangramento e necessidade de tratamento não puderam ser correlacionados com os tipos ou posição de suas mutações. No entanto, a análise molecular do VWF pode ser útil para fins de diagnóstico e aconselhamento.