Análise de ferramentas in silico para variantes sinônimas em genes de predisposição ao câncer - Scheid, Marina Roberta (2018)
Com a introdução do sequenciamento em massa nos testes de diagnóstico através de painéis para genes de predisposição ao câncer (GPC) houve um aumento significativo no número de variantes detectadas. Uma grande parcela destas variantes são variantes sinônimas (VS), e a maioria inferem-se serem benignas, sem passar por uma avaliação de patogenicidade. Contudo, estima-se que um menor percentual de VS é capaz de alterar a expressão gênica se estiverem inseridas em regiões conservadas, como sítios de splicing, ílhas CpG, ou ainda interferir na conformação secundária do RNA mensageiro (mRNA). Nesse trabalho, foi avaliada a acurácia de ferramentas in silico gratuitas que analisam VS. Ademais, foram avaliadas VS obtidas do banco de dados público (ExAC) e de indivíduos avaliados para genes associados a câncer hereditário. As ferramentas in silico selecionadas para as análises foram divididas em três grupos: ferramentas para análise de conservação (PhasCons e PhiloP), ferramentas de múltiplas anotações (PredictSNP, CADD, DANN, FATHAMM, FUNSEQ2, GWAVA e o software Silent Variant Analizer (SilVA)), e ferramentas para análise de splicing (SSF, NNSplice, MaxEntScan e GeneSplicer). Para os testes de sensibilidade e especificidade foi realizada uma curva-ROC (Receiver Operating Characteristic Curve) para cada ferramenta utilizando o software SPSS. Variantes depositadas no ClinVar e sabidamente patogênicas foram utilizadas como padrão-ouro. Foram selecionadas VS de dois grupos: o primeiro composto por variantes depositadas no banco de dados ExAC, enquanto que o segundo, era composto por variantes identificadas em indivíduos com critérios clínicos para câncer hereditário e que realizaram sequenciamento completo de TP53, BRCA1 e BRCA2 no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Todas as VS foram avaliadas pelos preditores que obtiveram melhores valores de sensibilidade-especificidade. A análise de estrutura secundária (ES) e diferença da energia de dobramento (ΔMEF) do mRNA foi realizada através do RNAfold e a presença de ilhas CpG pelo programa MethPrimer. Como resultados, o software SilVA apresentou a maior acurácia entre todas as ferramentas de múltiplas anotações avaliadas, e apenas o preditor GWAVA não apresentou valores significativos de área abaixo da curva (AAC) para as VS avaliadas. Todos as ferramentas de conservação e splicing apresentaram valores significativos AAC. Do total de 4.324 VS selecionadas a partir do ExAC, aproximadamente 1% destas foram preditas como provavelmente ou possivelmente patogênicas pelo software SilVA. Análises adicionais demonstraram que alteração no splicing deve ser o principal 6 mecanismo de patogenicidade presente nesse grupo. Em relação as VS identificadas no segundo grupo de estudo, foram selecionadas VS cuja frequência populacional era inferior a 0,05. Quatorze variantes sinônimas em TP53 (n=3), BRCA1 (n=2) e BRCA2 (n=9) foram selecionadas para a análise por ferramentas in silico. As análises estruturais de dobramento do mRNA demonstraram que duas VS identificadas em TP53 (c.66A>G e c.108G>A) apresentaram alterações na energia termodinâmica de dobramento ou na estrutura do mRNA. Também identificamos que c.1395A>C e c.3756A>T, ambas em BRCA2, podem resultar em alterações no splicing. Este foi o primeiro estudo avaliando a acurácia de ferramentas in silico para VS identificadas em um grupo abrangente de genes de predisposição ao câncer. Estudos funcionais complementares são necessários para a confirmação do potencial patogênico destas alterações moleculares.