Saponinas dos frutos de ilex paraguariensis A. St. Hil. (mate) : desenvolvimento de metodologia analítica, estudos físico-químico e biológico - Peixoto, Maria Paula Garofo (2009)
O presente trabalho teve por objetivo a avaliação físico-química e biológica de uma fração de saponinas enriquecida, obtida a partir de frutos verdes de Ilex paraguariensis A. St. Hil (mate). A espécie apresenta grande importância econômica para vários países sul-americanos, dentre eles o Brasil. Os frutos verdes da espécie acumulam significativa quantidade de saponinas, entretanto, são considerados subproduto da indústria do beneficiamento das folhas de mate. O extrato liofilizado dos frutos (EX40) foi obtido por turboextração na proporção planta-solvente de 1:10 utilizando como solvente solução hidroalcoólica a 40%. Para análise do extrato bruto foi desenvolvido e validado um método analítico por CLAE-UV, que permitiu: 1) quantificar o marcador químico ilexosídeo II em EX40; 2) estimar o conteúdo em saponinas totais do extrato, tendo sido obtidos valores de 8,2 g% e 47,6 g% respectivamente. Uma fração enriquecida em saponinas, denominada MSF, foi obtida mediante fracionamento em fase sólida a partir de EX40, utilizando resina hidrofóbica poliaromática e gradiente metanol:água de polaridade decrescente. Os maiores teores de saponinas foram obtidos para as frações contendo 70 e 90 % de metanol. A reprodutibilidade do processo foi avaliada por CLAE-UV, considerando o desvio padrão relativo (DPR) entre a área dos dois picos majoritários de MSF produzidas em seis lotes distintos. Valores de DPR de 8,17% para o pico I (ilexosídeo II) e 5,96 % para o pico II (majoritário) foram obtidos. A toxicidade da fração foi avaliada pelo potencial hemolítico in vitro e citotoxicidade sobre cultura de células de mamífero (MDBK ATCC CCL-22). Para atividade hemolítica foi determinado um valor de IC50 de 0,2 g/L (0,22 mM, expresso em ilexosídeo II). O valor de IC50 para citotoxicidade foi 3,8 g/L (4,04 mM, expresso em ilexosídeo II), caracterizando um produto de baixa toxicidade. Dentre as várias atividades biológicas descritas para saponinas, selecionouse avaliar MSF quanto ao seu potencial como imunoadjuvante, assim como a atividade tricomonicida. Para o primeiro caso, MSF foi testada em uma vacina contendo herpesvírus bovino tipo 5 como antígeno viral, nas doses de 100 e 500 μg. Entretanto, o incremento no título de IgG totais, avaliado por ELISA, não foi significativo. A atividade tricomonicida foi comparada aos tensoativos polissorbato 80 e tiloxapol e a uma fração enriquecida em saponinas de Quillaja saponaria. Após 24 h de incubação foi observado para MSF um efeito dose-dependente, atingindo letalidade total dos trofozoítos na concentração de 0,6 g/L. Esse efeito foi superior ao observado para polissorbato 80 e tiloxapol e similar ao de quillaia. O tratamento com metronidazol, administrado tanto após tratamento prévio dos trofozoítos com MSF quanto em associação com essa fração, não revelou qualquer alteração significativa no efeito de ambos os produtos, o que sugere ausência de interação entre MSF e MTZ e a possível existência de mecanismos de ação distintos. A caracterização físico-química enfatizou o estudo do tamanho e forma das micelas, seu comportamento reológico e capacidade de solubilizar compostos hidrofóbicos. A concentração micelar crítica foi determinada em 0,41 g/L utilizando um corante hidrofóbico como marcador. A análise por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e CRIO-MET revelou a presença simultânea de micelas alongadas, com tamanho superior a 500 nm, e micelas esféricas de tamanho menor. Para a fração de micelas esféricas, a análise por espalhamento de nêutrons a baixo ângulo permitiu estabelecer diâmetro de 17,9 Å, perfazendo 23,1 e 32,6 % das micelas observadas em soluções de MSF a 0,5 e 1,0 % m/v, respectivamente. O comportamento reológico de MSF nas concentrações de 0,25 a 4,0 %, determinado por reometria dinâmica com controle de deformação, foi do tipo viscoelástico para todas as concentrações. Esse fato corrobora a existência de agregados não-esféricos, filiformes, semelhantes a micelas tipo wormlike. A solubilização micelar de fármacos mediante MSF foi avaliada utilizando como substâncias-modelos os fármacos flurbiprofeno – FLB (ácido fraco) e carbamazepina - CBZ (base fraca), ambos pouco solúveis, e saponinas de quillaia como produto de comparação. Nas concentrações de 0,13 a 1,5 % as saponinas de quillaia foram mais eficientes frente ao flurbiprofeno, enquanto MSF foi capaz de aumentar significativamente a solubilidade da carbamazepina. O incremento na solubilização gerado por MSF foi de 0,0145 e 0,0129 g/L para CBZ e FLB, respectivamente.