Caracterização de marcadores de virulência em Paracoccidioides brasiliensis - Kioshima, Érika Seki [UNIFESP] (2009)
A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença sistêmica de caráter granulomatoso, prevalente na América do Sul, causada pelo fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis. O fungo apresenta estrutura complexa de proteínas e glicoproteínas e dentre esses componentes, alguns estão envolvidos na patogenicidade da doença. A recuperação da virulência de isolados por meio de passagem in vivo foi realizada com sucesso em nosso laboratório. Os isolados Pb18 atenuado e virulento foram analisados sob diversos ângulos para confirmação dessa modificação. Os resultados de curva de sobrevida, recuperação de CFU de órgão e histologia, mostraram claramente as diferenças no padrão de patogenicidade desses dois isolados. Outras características também foram avaliadas como morfometria, padrão de crescimento e ultraestrutura celular. Análises de expressão gênica diferencial apontaram um perfil de regulação positiva para genes relacionados ao metabolismo de proteínas, de lipídeos e aminoácidos. Algumas moléculas anteriormente descritas como putativos fatores de virulência foram moduladas positivamante, entre as quais podemos citar a calmodulina, proteína kex-like e hsp70. Entretanto, ainda pouco se sabe sobre estes fatores virulência para maioria dos fungos dimórficos, entre eles o P.brasiliensis. Várias técnicas têm sido utilizadas, sem sucesso, para caracterização destas moléculas. Utilizando a metodologia de Phage display, foram selecionados três fagos que se ligam preferencialmente ao isolado Pb18 virulento. Por meio de ensaio de ligação, o fago p04 foi capaz de distinguir graus de virulência de outros quatro isolados. As imagens obtidas por microscopia confocal mostraram que o pep04, acoplado a 6-FAM, foi internalizado somente por leveduras do isolado virulento. Imagens seriadas indicam marcação do meio intracelular, frequentemente associada ou co-localizada à marcação por DAPI. Estes resultados demonstraram que ambos, pep04 e p04, podem ser considerados biomarcadores de virulência na PCM. Para avaliar as consequências das interações destes biomarcadores com células fúngicas, foram realizados ensaios in vitro e in vivo. O fago p04 foi suficiente para impedir a implantação e disseminação do fungo. Além disso, foi capaz de reduzir o número de CFUs recuperadas de animais tratados com este fago, quando comparado ao controle (fago sem inserto). Experimentos in vitro utilizando o pep04 demostraram a atividade fungicida deste peptídeo contra, apenas, o isolado virulento. Desta foram, estes biomarcadores poderão ser utilizados tanto no diagnóstico, quanto na pratica clínica como adjuvante terapêutico.