Análise da Diversidade Intraespecífica de Trichosporon asahii e Trichosporon faecale por Biologia Molecular e MALDI-TOF MS - Francisco, Elaine Cristina [UNIFESP] (2015)
Trichosporon spp. são leveduras do filo Basidiomycota comumente responsáveis por infecções superficiais. Nos últimos anos, têm emergido como agente em infecções invasivas, principalmente em pacientes com doenças hematológicas malignas e sob uso de dispositivos médicos invasivos, com elevados índices de morbidade e mortalidade desses pacientes. A identificação rápida e acurada das espécies causadoras de infecções, realizada por sequenciamento da região IGS1 do rDNA, é fundamental para caracterização de sua epidemiologia bem como para o delineamento de estratégias de controle e tratamento. Apesar da importância das infecções por Trichosporon spp, há poucas informações sobre a epidemiologia das espécies não-T. asahii bem como poucos estudos buscando validar novas estratégias diagnósticas, em particular a utilização de MALDI-TOF MS para o estudo deste gênero. Objetivos: analisar a prevalência e gerar sequências de alta qualidade da região IGS1 de todos os isolados de Trichosporon spp. do Laboratório Especial de Micologia-LEMI/UNIFESP; descrever a diversidade genotípica das cepas de T. asahii e T. faecale e correlacioná-las com origem geográfica e sítio de isolamento; analisar os perfis proteicos gerados por MALDI-TOF para diferentes genótipos de T. asahii e T. faecale a partir de três protocolos de extração de proteínas distintos; identificar possíveis picos de massas proteicas com potencial discriminatório para a distinção intraespecífica de T. asahii e T. faecale. Material e Métodos: Foram utilizados 364 isolados de Trichosporon spp. recebidos ao longo de 18 anos provenientes diferentes área geográfica e sítios anatômicos. A identificação foi realizada por PCR e sequenciamento da região IGS1 do rDNA. As sequências foram analisadas no programa Phred Phrap Consed, e comparadas com as sequências depositadas no banco genômico do NCBI. A diversidade haplotípica e a variabilidade intraespecífica de T. asahii e T. faecale foram avaliadas nos programas Seaview 4.1.1. e DNAsp 5.10.0. A rede haplotípica foi construída pelo método de Median-Joining no Network 4.6.1.3. Para o ensaio de MALDI-TOF MS, 43 isolados de T. asahii, e 5 de T. faecale foram simultaneamente avaliados em três protocolos de extração proteica distintos. A busca de massas diferenciais foi realizada no ClinProTools pelo teste ANOVA. Resultados: Identificou-se um total de 9 espécies de Trichosporon spp, sendo T. asahii a espécie prevalente (75%) em todos os sítios amostrados. Quanto a diversidade genotípica, foram identificados 9 genótipos para T. asahii (incluindo 4 ainda não descritos) e 3 para T. faecale (incluindo 1 não previamente descrito). Não houve correspondência entre os arranjos filogenéticos e dendrogramas constituídos pelos perfis proteicos por MALDI TOF MS. Perfis proteicos obtidos por MALDI TOF MS não mostraram poder discriminatório para identificação intraespecífica de T asahii. Foram encontradas massas diferenciais para isolados de T. faecale nos protocolos de extração com ácido fórmico. Conclusões: Trichosporon asahii foi a espécie prevalente encontrada em todos os sítios anatômicos analisados, seguido por T. faecale e T. inkin. A identificação de Trichosporon spp. por sequenciamento da região IGS1 do rDNA gerou sequências de alta qualidade para os isolados clínicos de Trichosporon spp., inclusive, para espécies com proximidade filogenética, demostrando grande diversidade de espécies patogênicas emergentes. Foram identificados 9 genótipos para T. asahii e 3 genótipos de T. faecale e os 3 diferentes protocolos de extração proteica utilizados nos ensaios com amostras de T. asahii não permitiram a discriminação de diferenças intraespecíficas de T. asahii . Contudo, foi possível tal diferenciação para T. faecale quando usado os protocolos de extração com ácido fórmico.