Estudos sobre a estrutura e organização das extremidades cromossômicas de Trypanosoma cruzi com ferramentas de bioinformática, cromossomo artificial e radiação ionizante - Barros, Roberto Rudge de Moraes [UNIFESP] (2011)
Formas tripomastigotas de T. cruzi expressam glicoproteínas de superfície da superfamília das trans-sialidases (TS), implicadas nos processos de invasão da célula hospedeira. As TSs constituem uma grande família gênica codificando grande número de proteínas de superfície. Populações de T. cruzi podem expressar diferentes formas antigênicas de TS. A identificação de genes TS localizados próximos aos telômeros sugeriu que as terminações cromossômicas poderiam atuar como local de geração de novas variantes TS. O objetivo deste trabalho é caracterizar as regiões teloméricas e subteloméricas do T. cruzi e investigar seu papel na recombinação e geração de variantes TS. Idfentificamos 49 “contigs” obtidos durante o projeto genoma que contém a repetição telomérica (TTAGGG). Destes “contigs”, em 45 a repetição telomérica está localizada em uma extremidade, e em quatro “contigs” está localizada internamente. A presença de repetições teloméricas internas poderia ser explicada por erros no alinhamento in silico das sequências ou por eventos de fusão de telômeros, formando cromossomos com repetições teloméricas intersticiais. Todos os contigs apresentam uma sequência conservada de 189 pb adjacente à repetição telomérica, denominada junção telomérica, que representa uma assinatura de extremidades cromossômicas de T. cruzi. Durante o trabalho, localizamos 40 dos 49 “contigs” teloméricos nos “contigs” cromossômicos de T. cruzi e relacionamos algumas extremidades cromossômicas às bandas cromossômicas separadas por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). A estrutura das sequências subteloméricas de T. cruzi varia muito, principalmente como resultado de diferenças na quantidade e na organização de genes de proteínas de superfície (TS e DGF-1), genes “retrotransposon hot spot” (RHS), retroelementos e genes de RNA helicase e N–acetiltransferase entre as extremidades cromossômicas. As regiões subteloméricas possuem um grande número de pseudogenes, porém, também contêm genes completos, possivelmente expressos. Isto indica que estas regiões não representam apenas DNA não-funcional adjacente aos telômeros, mas formam parte do genoma expresso. O tamanho das regiões subteloméricas varia de 5 kb a 182 kb, sendo que as pequenas extremidades podem ter surgido de eventos recentes de quebra cromossômica e reparo dos telômeros. A falta de sintenia nas regiões subteloméricas sugere que genes localizados nestas regiões estão sujeitos a recombinação, o que aumenta sua variabilidade, inclusive em cromossomos homólogos. A presença de genes típicos subteloméricos pode facilitar a ocorrência de mecanismos de recombinação homóloga ou de recombinação mediada por micro-homologia, que podem usar estas regiões para o emparelhamento e recombinação de extremidades livres. Para verificar se eventos de recombinação envolvendo as extremidades cromossômicas estão ocorrendo no parasita construímos um cromossomo artificial de T. cruzi (TAC), uma construção linear que pode ser eficientemente introduzida em epimastigotas mantendo-se estável como um cromossomo do parasita. Estas construções (pTAC-gp85) não se integram ao genoma do parasita, e contém sequências subteloméricas, incluindo um pseudogene gp85, marcadores de seleção em ambos os braços e o gene repórter GFP. Após a eletroporação de epimastigotas com as construções, estas se mantiveram lineares epissomais e estáveis, por diversas gerações, mesmo na ausência de pressão seletiva com antibióticos. Ao longo do ciclo de vida do parasita, o cromossomo artificial se manteve estável, segregando-se junto aos outros cromossomos do parasita. Não foram detectados eventos de recombinação envolvedo deslocamento de genes do cromossomo articial para outro sítio genômico. Eventos de recombinação envolvendo genes TS subteloméricos podem estar ocorrendo em T. cruzi, mas possivelmente com menos frequência do que o esperado pela diversidade genética observada entre as linhagens e o grande número de variantes de antígenos de superfície no parasita. Eventos de recombinação em alguns parasitas da população dificilmente seriam detectados pela estratégia utilizada em nossos experimentos. O T. cruzi apresenta alta resistência aos efeitos da radiação ionizante, apresentando grande capacidade de reparo do DNA. A radiação gama causa a paralização do ciclo celular e fragmentação cromossômica, associada a quebras na dupla fita de DNA (DSBs – “double strand breaks”). No entanto, 48h após a irradiação, bandas cromossômicas de tamanho normal foram detectadas por PFGE. Embora tenha sido proposto que a recombinação mediada por Rad51 tenha papel importante no reparo de lesões do DNA, muitas dúvidas permanecem sobre a resposta do T. cruzi à radiação. Portanto, efetuamos experimentos para compreender o reparo dos cromossomos após a exposição de epimastigotas à radiação gama. Epimastigotas em crescimento exponencial (clone CL Brener e cepas G e CL) foram expostos a doses de 500 a 2000 Gy de radiação gama. Após a irradiação verificamos em intervalos regulares a sobrevivência das células, o crescimento celular, o dano e o reparo do DNA. A inibiçao do crescimento celular ocorreu imediatamente após a irradiação, e permaneceu por 96 h nos parasitas irradiados com 500 Gy e por até 12 dias nos parasitas irradiados com 1000 Gy. Parasitas irradiados com doses maiores (1500 e 2000 Gy) não sobreviveram. Utilizando ensaios que detectam DSBs (TUNEL) e fragmentação cromossômica (PFGE), avaliamos o efeito genotóxico da radiação em epimastigotas. Seis dias após a irradiação, a porcentagem de células irradiadas com 500 Gy marcadas positivamente com TUNEL é similar à de células não irradiadas e 3 vezes menor que nas células irradiadas com 1500 e 2000 Gy. Acreditamos que a fragmentação cromossômica e o número de células marcadas com o ensaio de TUNEL crescem conjuntamente. Comparamos o nível de sintenia entre parasitas irradiados e não irradiados pela análise de segmentos cromossômicos homólogos. Células irradiadas exibem uma impressionante conservação na organização dos genes em relação aos parasitas não irradiados. Nossos resultados confirmam a grande capacidade de reparo de DNA e de resistência à radiação apresentada pelo T. cruzi.