Expressão e purificação do domínio de ligação ao receptor (RBD) da proteína Spike do vírus SARS-Cov-2 da cepa de Wuhan - Vaz, Fábio Antonio Busoli [UNIFESP] (2024)
Objetivos: O objetivo foi a obtenção da RBD de SARS-CoV-2 e realizar estudos de expressão, solubilização e purificação da RBD-wt recombinante a fim de encontrar uma condição ótima. Métodos: A construção plasmidial contendo a RBD-wt utilizada para obtenção da variante P1 por meio da estratégia de mutação sítio-dirigida por reações de PCR. O fragmento de DNA foi purificado e inserido no vetor pRSET-A. O DNA plasmidial da construção contendo a RBD-wt foi utilizado na transformação de células BL21(DE3) pLysS competentes, por choque térmico e, após a confirmação dos clones positivos, foram feitos os testes de expressão a fim de otimizar a produção da RBD-wt recombinante. Após os testes de expressão, foi realizado um teste de solubilidade e foi feita a detecção da RBD-wt por Western Blot. Após esses testes, foi feita a purificação da RBD-wt usando dois métodos diferentes de expressão para obter a proteína recombinante. A purificação foi realizada por cromatografia de afinidade. Resultados: Bactérias transformadas com plasmídeos contendo a sequência da RBD-wt foram confirmadas por PCR de colônia. Os clones positivos foram utilizados para a expressão da proteína recombinante que foi confirmada por SDS-PAGE apresentando uma banda proteica de aproximadamente 32 kDa. Um clone positivo foi utilizado para os testes de expressão, sob diferentes concentrações do agente indutor, tempos de incubação e temperaturas. Os resultados mostraram que as concentrações testadas do indutor não afetaram a expressão da proteína. Contudo, o tempo de incubação e a temperatura afetaram os níveis de expressão. As melhores condições observadas para a expressão de RBD-wt foram utilizando o meio de autoindução. A proteína RBD-wt recombinante foi obtida majoritariamente na forma insolúvel, dados confirmados por SDS-PAGE e Western Blotting. A proteína recombinante foi solubilizada em 8 M de ureia e purificada por cromatografia de afinidade em coluna His-Sepharose, sendo realizado o refolding dentro da coluna. Desta forma, a proteína solúvel foi obtida na eluição. A construção plasmidial contendo a sequência da RBD-P1 foi obtida com sucesso utilizando mutação sítio-dirigida e a sequência da RBD-wt como DNA-molde. A sequência correta foi confirmada por sequenciamento DNA. Conclusão: Dentre as condições testadas para a expressão da RBD-wt, não foi observado uma condição que aumentasse o rendimento da proteína recombinante solúvel quando comparada com as condições de solubilização e refolding publicadas anteriormente. Neste trabalho foi possível obter a construção plasmidial contendo a sequência de RBD-P1, que poderá ser utilizada em estudos futuros.