Vias de sinalização intracelular envolvidas no efeito proliferativo de relaxina em células de Sertoli - Nascimento, Aline Rosa [UNIFESP] (2011)
Relaxina é um peptídeo relacionado à insulina que ativa o receptor acoplado a proteína G RXFP1. Apesar da relaxina desempenhar funções importantes no sistema reprodutor feminino, seu papel fisiológico no sistema reprodutor masculino é ainda incerto. Demonstramos previamente que relaxina e RXFP1 estão expressos em testículos (FILONZI et al., 2007; CARDOSO et al., 2010). Relaxina e RXFP1 estão imunolocalizados em células de Sertoli e células germinativas, sugerindo que relaxina pode ser importante para a espermatogênese. De fato, relaxina induziu a proliferação de células de Sertoli em cultura. Receptores acoplados a proteína G podem ativar a proliferação celular por diversos mecanismos: transativação de receptores tirosina quinase e/ou ativação de quinases da sinalização intracelular que culminam na ativação das vias da MAP quinase (ERK1/2) ou PI3K. O objetivo do presente estudo foi investigar as vias de sinalização que levam à resposta proliferativa de relaxina em células de Sertoli de ratos. Cultura primária de células de Sertoli foi obtida de ratos Wistar de 15 dias de idade. As células foram incubadas na ausência ou na presença de concentrações crescentes de relaxina (25200 ng/ml), por diferentes períodos (5, 10 e 30 minutos), a 35°C. Para caracterizar vias sinalizadoras que antecedem a fosforilação de ERK1/2, as células foram previamente tratadas com o inibidor de MEK1/2, U0126 (20 μM por 30 minutos; N=3); o inibidor da atividade quinase do receptor de EGF (EGFR), AG 1478 (1 μM por 15 minutos; N=4); o inibidor da família de Scr tirosina quinases, PP2 (5 nM por 30 minutos; N=4); o inibidor de metaloproteases, GM 6001 (200 nM por 30 minutos; N=4); o inibidor de PI3K, wortmannin (100 nM por 30 minutos; N=5); o inibidor de PKA, H89 (2 μM por 2 horas; N=5); o inibidor geral PKC, GF 109203X (5 μM por 30 minutos; N= 3) ou o inibidor de Gi/o, toxina pertussis (PTX, 100 ng/ml por 16 h; N=2). Fosforilação de ERK1/2 foi determinada por análises de Western Blot. Relaxina aumentou a fosforilação de ERK1/2 de modo dependente do tempo e da concentração. O pico de fosforilação de ERK1/2 ocorreu aos 5 minutos e com 50 ng/ml de relaxina (N=3). Fosforilação de ERK1/2 induzida por relaxina foi inibida pelo prétratamento com AG 1478, PP2, wortmannin, GF 109203X e toxina pertussis, mas não com H89 e GM 6001. O efeito da relaxina na proliferação celular foi determinado pela incubação das células com 50 ng/ml de relaxina, por 24 horas, e pela determinação da incorporação de [3H] timidina, na ausência ou na presença dos inibidores importantes da via ERK1/2, determinados na etapa anterior. A proliferação celular mediada por ERK1/2 foi inibida pelo inibidor de MEK1/2, U0126, confirmando o envolvimento de ERK1/2 no efeito proliferativo da relaxina em células de Sertoli e pelo inibidor de PI3K, wortmannin. Outros inibidores da via da ERK1/2, como o inibidor de PKC, GF 109203X e o inibidor da tirosina quinase do EGFR, AG 1478, não foram efetivos. Nossos resultados sugerem que relaxina estimula fosforilação de ERK1/2 e a via da PI3K, e que PI3K tem um papel central no efeito mitogênico da relaxina em células de Sertoli. Os resultados obtidos nos levam a propor o seguinte esquema de eventos para explicar o mecanismo envolvido na proliferação de células de Sertoli induzida por relaxina: RXFP1 ativado se acopla à proteína Gi, liberando as subunidades βγ que ativam a PI3K, que, por sua vez, pode fosforilar e ativar PKC, Scr e Ras. Todas essas vias podem levar à ativação de Raf/MEK/ERK; Além disso, Scr pode fosforilar o EGRF, que também contribui para ativação de ERK1/2. ERK1/2 pode regular a transcrição de genes que regulam o ciclo celular. Altenativamente, PI3K também pode diretamente estar envolvida na regulação da transcrição de genes que regulam o ciclo celular. Mais estudos são necessários para esclarecer os mecanismos envolvidos na regulação do ciclo celular e na proliferação celular induzida por relaxina. Este evento certamente desempenha um papel central na espermatogênese e fertilidade masculina e relaxina emerge como um novo fator parácrino/autócrino que regula a função das células de Sertoli.