Comunicação celular in vitro mediada por vesículas extracelulares isoladas de fungos patogênicos cultivados em condições de estresse - Silva, Camila Pereira da [UNIFESP] (2024)
Vesículas extracelulares (EVs) são estruturas arredondadas delimitadas por uma membrana lipídica de camada dupla. Elas transportam moléculas de natureza diversa e de forma protegida para o meio extracelular, com potencial de estabelecer comunicação à distância. Dados prévios do laboratório mostraram a capacidade de EVs do patógeno fúngico Paracoccicioides brasiliensis modular o fenótipo de células do mesmo isolado e apontaram para uma ampla alteração no proteoma e transcriptoma de EVs de P. brasiliensis (isolado vPb18, virulento) e Candida albicans (cepa 90028) cultivados em condições de estresse oxidativo e nitrosativo subletal. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de EVs produzidas nessas condições no fenótipo de outras células fúngicas. Os experimentos de dose-resposta mostraram que concentrações de 5 mM de NaNO2 e 0,5 mM de H2O2 são subletais, porém causam estresse em células de vPb18 cultivadas na presença de estressor por 24 h, a 36oC, em meio sólido de Ham’s F-12 acrescido de 1,5% de glicose (Ham/glc). Para C. albicans, a concentração de 5 mM de H2O2 é subletal e causa estresse nas mesmas condições de cultura, como sugerido pela incorporação do reagente di-hidroetílico. As vEVs produzidas por vPb18 cultivado em condições subletais de estresse nitrosativo (vEVNO) e oxidativo (vEVOxi) não apresentaram diferença estatisticamente significante, em relação aos respectivos controles vEVcNO e vEVcOxi, no diâmetro médio estimado por rastreamento de nanopartículas (NTA), na variação do potencial Zeta, ou no conteúdo de proteína. O diâmetro hidrodinâmico avaliado por dispersão dinâmica de luz (DLS) não variou para vEVNO, mas foi estatisticamente superior para vEVOxi, assim como o índice de polidispersão, porém o conteúdo de esterol foi estatisticamente inferior ao do controle. As EVCaOxi, produzidas por C. albicans cultivada sob estresse oxidativo subletal, apresentaram valores estatisticamente semelhantes aos do controle EVcCa no diâmetro aferido por NTA, na variação do potencial Zeta e no índice de polidispersão. O valor médio de DLS e o conteúdo de proteína foram estatisticamente superiores para EVCaOxi em relação ao controle EVcCa. O efeito de EVs foi testado por co-incubação por 4 h, a 36oC, de vEVNO, vEVOxi e seus controles com células de P. brasiliensis aPb18 (variante atenuada) e Pb3, com subsequente cultivo em spots de diluição seriada em meio Ham/glc, acrescido de agentes estressores. Em nossas condições experimentais, observamos uma visível redução da resistência de aPb18 ao Congo red e ao NaCl após pré-incubação com vEVOxi. Outros efeitos foram discretos e independentes da origem das vEVs, a saber: a) aumento da resistência de aPb18 ao sorbitol após pré-incubação com vEVNO,vEVOxi e seus controles; b) sutil aumento da resistência do isolado Pb3 ao NaCl, mediado por vEVNO, seu controle e ao Congo red, mediado por vEVOxi e seu controle. A co-incubação de EVCaOxi e seu controle com células de C. albicans resultou em um discreto aumento de resistência ao Calcofluor white, porém não ao Congo red ou ao H2O2, nas condições testadas. Entretanto, EVCaOxi causou uma sutil diminuição de crescimento das leveduras mesmo na ausência de estressor. Em conjunto, os resultados deste trabalho sugerem que as EVs produzidas sob estresse oxidativo subletal sofrem uma variação na constituição da superfície tanto para P. brasiliensis como para C. albicans, resultando em aumento no diâmetro hidrodinâmico. Todavia, a carga superficial de potencial Zeta, que foi negativa sugerindo estabilidade das partículas, aparentemente não foi afetada. Por outro lado, a redução de resistência de aPb18 ao Congo red e ao NaCl, mediada por vEVOxi, assim como a redução da viabilidade de C. albicans, mediada por EVCaOxi, deve estar relacionada a alterações nas vEVs causadas pelo estresse oxidativo. Os resultados desta dissertação são originais e serão explorados mais amplamente no laboratório no futuro próximo.