Uso de antagonista farmacológico no estudo do papel do receptor P2X7 nas alterações causadas por crises induzidas por pilocarpina - Araújo, Michelle Gasparetti Leão [UNIFESP] (2015)
Introdução: A epilepsia do lobo temporal (ELT) é o tipo mais comum de epilepsia focal com crises frequentemente refratárias às drogas antiepilépticas, sendo a esclerose hipocampal (EH) a anormalidade estrutural mais comum. O modelo de epilepsia induzido por pilocarpina reproduz as principais características da ELT. A pilocarpina é um agonista colinérgico que administrada em altas doses via sistêmica, gera status epilepticus (SE), EH, reorganização sináptica e crises espontâneas e recorrentes. O SE induz alterações em sistemas neurotransmissores dentre eles os purinérgicos. Estudos mostram um aumento na expressão de subtipos de receptores purinérgicos P2X no modelo de ELT induzido por pilocarpina, e o aumento do receptor P2X7 (P2X7R) foi apontado como mecanismo que favorece a excitotoxicidade e a hiperexcitabilidade. O aumento da sinalização purinérgica é, portanto, uma das alterações causadas por crises e necessita de elucidação. O uso de antagonistas tem auxiliado o conhecimento dessa sinalização na epilepsia. Objetivos: Elucidar o papel dos P2X7R, através da administração do antagonista AZ10606120 (AZ), no processo de morte celular hipocampal e na epileptogênese em animais submetidos ao modelo de epilepsia induzido por pilocarpina, e na mobilidade de cálcio em fatias hipocampais. Métodos: O AZ foi administrado por via intracerebroventricular (i.c.v.) nas doses 1μg, 2μg e 3μg, 30 minutos após SE, em animais submetidos ao modelo da pilocarpina e em controles, e o processo de morte celular hipocampal analisado por meio de Fluoro JadeB (FJB). A dose que causou menor número de células FJB positivas foi selecionada para o estudo (3μg). Assim, quatro grupos foram estudados: Salina+Veículo, Salina+AZ, Pilo+Veículo, Pilo+AZ. A quantificação dos P2X7R foi analisada por Western Blot. Para o estudo do cálcio intracelular, foram empregadas fatias hipocampais de animais controle, que foram incubadas com o marcador de cálcio Fluo4AM. Estas foram incubadas com AZ nas concentrações de 2,5μM, 5μM e 10μM ou salina, e estimuladas com BzATP. A concentração de AZ que causou menor taxa de cálcio intracelular (2,5μM) foi empregada nos grupos estudados: Salina+BzATP, Salina+AZ+BzATP, Pilo+BzATP e Pilo+AZ+BzATP. A avaliação comportamental foi realizada durante 30 dias a partir da indução do SE em animais submetidos ao modelo da pilocarpina ou salina, com ou sem administração de AZ. Resultados: A dose 3μg do AZ i.c.v. causou redução do número de células marcadas com FJB nas regiões de CA1, CA3 e hilo do giro dentado em ratos submetidos ao SE por pilocarpina. Essa dose também diminuiu a expressão dos P2X7R (42%) nos animais do grupo Pilo+AZ quando comparados aos do grupo Pilo+Veículo. Os animais tratados com AZ apresentaram menor taxa de mortalidade 24 horas após o SE, porém houve um aumento no número de crises, principalmente nas de menor estadio (maioria com estadio 2 de Racine). A concentração de 2,5μM de AZ causou inibição na concentração de cálcio intracelular em fatias de hipocampo de ratos salina após estímulo com BzATP. No entanto, esse resultado não ocorreu em fatias hipocampais do grupo Pilo+AZ+BzATP onde observamos um aumento significante na concentração de cálcio comparado ao grupo Salina. Conclusão: A administração do AZ promoveu redução significativa da taxa de mortalidade, redução na expressão proteica dos P2X7R, redução da morte celular na formação hipocampal e um aumento de cálcio intracelular no hipocampo no período agudo. No período crônico, causou aumento no número de crises, principalmente de menor gravidade evidenciando o papel dos P2X7R na epilepsia induzida por pilocarpina. O quadro heterogêneo de respostas causadas pelo AZ indica que novos estudos são necessários para elucidar os mecanismos modulados por este antagonista.