Mecanismo de citotoxicidade do anticorpo monoclonal A4, que reconhece protocaderina β13, em células tumorais murinas e humanas - Santos, Luana Cheven Perbore dos [UNIFESP] (2010)
O melanoma cutaneo e um tumor originado a partir da proliferacao descontrolada de melanocitos. A incidencia do melanoma maligno tem aumentado significativamente nas ultimas decadas e se tornado um problema de saude publica em muitos paises. Na imunoterapia contra o cancer, anticorpos monoclonais (mAbs) sao utilizados como ferramentas para diagnostico, monitoramento e tratamento da doenca. A descoberta de novos alvos terapeuticos para mAbs em celulas tumorais, e a determinacao dos mecanismos de citotoxicidade gerados pelos mesmos pode ampliar significativamente as possibilidades e o sucesso dos tratamentos. Anteriormente em nosso laboratorio, Dobroff e colaboradores (2002) isolaram um mAb (mAb A4) que foi citotoxico in vitro sobre celulas de melanoma murino B16F10-Nex2 e sobre algumas celulas tumorais humanas, efeito independente do complemento, mas aumentado por este. O mAb A4 reduziu o desenvolvimento do melanoma murino B16F10-Nex2 in vivo, aumentando a sobrevida dos animais. O alvo do mAb A4 na superficie celular e a proteina Protocaderina ƒÀ13 (PCDHƒÀ13), membro da superfamilia das caderinas. A interacao entre ambos levou as celulas tumorais a morte, em processo sugestivo de apoptose (Dobroff et. al., 2010, em publicacao). Neste trabalho, verificamos a reatividade do mAb A4 com celulas do melanoma murino e com algumas outras linhagens tumorais humanas atraves de ELISAQuimioluminescente e Imunofluorescencia Indireta. A expressao do gene PcdhƒÀ13 foi verificada por RT-PCR nao quantitativo e a expressao da proteina PCDHƒÀ13, por Immunoblotting. Verificou-se que, somente celulas que expressam a proteina PCDHƒÀ13 na membrana plasmatica sao suscetiveis a acao do mAb A4. O mAb A4 foi citotoxico in vitro contra o melanoma murino e contra linhagens tumorais humanas, incluindo melanoma, carcinoma de colon, carcinoma de cervice uterino e glioblastoma. O mAb A4 nao foi citotoxico contra linhagens humanas de carcinoma de mama e contra a linhagem de melanocitos murinos imortalizados melan A, que nao expressam a PCDHƒÀ13. A interacao do mAb A4 com celulas B16F10-Nex2.1 in vitro ocasionou a endocitose do mAb A4 em vesiculas, rapida reducao nos niveis de ƒÀ-catenina livre no citoplasma e do fator de transcricao TCF-4, redistribuicao da ƒÀ-catenina para a periferia celular, ativacao das caspases-9, -3 e -6, exposicao de fosfatidilserina na membrana plasmatica, condensacao da cromatina e degradacao internucleossomal do DNA, corroborando a inducao de um processo de morte por apoptose pela via intrinseca nessa celula tumoral. Adicionalmente, observou-se o aumento da producao de especies reativas de oxigenio, que podem amplificar o processo apoptotico. A inibicao da via de sinalizacao da ƒÀ-catenina sugere que vias de sinalizacao intracelular que regulam o crescimento e a sobrevivencia foram inibidas pela interacao entre o mAb A4 e seu alvo na celula. A presenca de vesiculas sugestivas de autofagossomos nas imagens de microscopia de transmissao eletronica pode indicar a inducao de um processo de autofagia em paralelo ao processo apoptotico. Concluimos que o mAb A4 demonstrou ser um potencial agente anti-tumoral com atividade contra diversos tipos de tumores murinos e humanos. A proteina PCDHƒÀ13 pode ser um potencial marcador de malignidade para o melanoma. A interacao entre o mAb A4 e a PCDHƒÀ13 levou a celula de melanoma a morte atraves da inibicao da via de sinalizacao intracelular b-catenina/TCF-4 e da inducao de apoptose pela via intrinseca. O processo de autofagia pode ter uma possivel participacao no efeito anti-tumoral induzido pelo mAb A4.