Atividade citotóxica de secretoma de Aspergillus fumigatus em células de carcinoma de pulmão - Sousa, Ana Cristina Peres de [UNIFESP] (2017)
Introdução Aspergillus fumigatus é um fungo com elevada capacidade adaptativa e fatores de virulência que favorecem sua instalação e colonização no hospedeiro humano. Espécies do gênero Aspergillus são reconhecidas pela alta capacidade de produção de metabólitos secundários, extensivamente documentada na literatura. Dentre esses metabólitos, algumas moléculas isoladas são utilizadas como fármacos, ajudando no controle do colesterol (lovastatina) e até no combate a outros fungos (equinocandinas). Várias moléculas produzidas por A. fumigatus já foram testadas contra células na busca de moléculas bioativas. Dentre essas moléculas, a gliotoxina é uma das mais exploradas, inibindo a resposta imunológica do hospedeiro, modulando negativamente a angiogênese e induzindo várias linhagens celulares a apoptose. Diante da grande diversidade de moléculas produzidas por A. fumigatus, está justificado o interesse em explorar seu potencial biológico com foco na identificação de substâncias com atividade citotóxica em células de carcinoma de pulmão, órgão alvo de infecção por este agente no hospedeiro humano. Objetivo Obter secretoma de isolados clínicos de A. fumigatus e investigar a potencial atividade de citotóxica de suas frações sobre células A549. Metodologia Seis isolados clínicos de A. fumigatus provenientes de pacientes com aspergilose pulmonar foram identificados em nível de espécie por abordagem polifásica, incluindo sequenciamento da região ITS e dos genes Calmodulina e β-tubulina. Após padronização de condições ótimas para obterse amostras de secretomas de composição reprodutível (mesmo perfil quando avaliado por LC-MS), foi iniciada a triagem de atividade biológica destas moléculas através de ensaios de citotoxicidade em células A549, com mensuração de atividade metabólica através do ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil tetrazolium (MTT). Uma vez identificado o secretoma mais ativo, este foi submetido a fracionamentos sequenciais, através de Cromatografia Líquida (LC) preparativa, com o objetivo de purificar a fração responsável pelo efeito citotóxico encontrado. Ao final, planejou-se a realização de ensaios de morte celular com anexina V para analisar o padrão de morte celular induzido pela subfração ativa. Resultado Obteve-se êxito na padronização do cultivo de células A549 e da extração de secretoma em meio de cultura MMBA, cuja composição mostrou-se reprodutível em diferentes experimentos (LC-MS). Investigando a atividade biológica das amostras de secretoma de 6 isolados de A. fumigatus, identificou-se o isolado 934 como aquele com maior efeito citotóxico nos ensaios de MTT. A partir deste achado, foram realizados 2 fracionamentos sequenciais do secretoma, sendo possível isolar a subfração identificada como Z5 que apresentou atividade citotóxica consistente, reduzindo em 90% a viabilidade celular quando comparado ao controle (p < 0,02). O ensaio de anexina V permitiu concluir que essa subfração induz, majoritariamente, a apoptose em células A549. Novos ensaios são necessários para caracterizar a subfração de secretoma de A fumigatus que apresentou atividade citotóxica, bem como para confirmar sua potencial atividade antitumoral.